摘要
植保素是植物在整个生长周期中遭受各种胁迫因子侵害后，在侵害部位附近产生和积累的具有针对性抗菌活性的低分子量次生代谢产物，在保护植物免受病原菌、害虫的侵害等方面至关重要。 单线态氧（Singlet oxygen,1O2）是植物叶绿体中产生的最主要的活性氧，在活性氧引起的叶片细胞死亡过程中起主要作用。1O2一方面能引起细胞氧化损伤甚至导致细胞死亡，另一方面可作为信号分子参与细胞的各种活动。 TeA（Tenuazonic acid）是链格孢菌（Alternaria alternata）产生的次生代谢物，是一种非寄主选择性毒素，能杀死绝大多数植物，但棉花和烟草对其高度不敏感。前期研究发现棉花对TeA的不敏感是由于棉酚的存在抑制了1O2基因表达水平，进而阻碍了病害发展，使植株对病害产生抗性。对拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株进行外源棉酚预处理后，拟南芥中1O2标记基因表达水平明显降低，对TeA产生了一定抗性。这就促使我们思考植保素在TeA激活的EX蛋白依赖的1O2信号途径中可能发挥重要作用。为了探究1O2信号途径与植保素之间的交叉对话机制，本论文通过对植物进行外源植保素（亚麻荠素camalexin、东莨菪素scopoletin、棉酚gossypol）预处理，使用Imaging-PAM检测、TBD染色、荧光定量等实验方法，初步明确了：植保素对TeA引起的1O2基因表达存在抑制作用；植保素对flu（fluorescent）突变体因光暗转换而产生的1O2爆发有抑制作用并使其保持在较低水平，进而减轻叶片损伤，降低幼苗白化死亡率，缓解成熟苗的生长抑制；但植保素不影响1O2的产生。 首先，用TeA侵染低酚含量的陆地棉（Gossypium hirsutum）离体叶片发现，植保素预处理后的叶片部位病害程度明显减轻，病斑面积显著小于未经植保素预处理的对照组，PSⅡ最大潜在光合效率FV/FM显著高于对照组，这就说明外源添加植保素增强了无腺体陆地棉对TeA的抗性，这一结论在紫茎泽兰（Ageratina adenophora）和拟南芥Co l-0中也得到验证。为了进一步了解其作用机制，我们在模式植物拟南芥中进行深入研究。用TeA侵染最佳浓度植保素（camalexin0.5mM、scopoletin0.05mM、gossypol0.05mM）预处理后拟南芥，其荧光定量结果显示，经植保素预处理的叶片中1O2介导EX蛋白依赖的信号标记基因表达量显著低于未经植保素预处理的对照组，这就说明植保素对TeA引起的1O2基因表达存在抑制作用，从而减轻TeA引起的病害。 研究表明，拟南芥条件突变体flu经过黑暗及重新照光后，能特异性产生1O2爆发，从而导致幼苗萎蔫漂白，成熟植株生长受到抑制。对预处理后的flu幼苗进行光暗转换，结果发现，与未经植保素预处理的对照组相比，植保素预处理的flu幼苗所受损伤明显较小，PSⅡ最大潜在光合效率FV/FM显著高于对照组，细胞死亡情况明显比对照组轻。对flu幼苗用最佳方式进行植保素预处理（最佳浓度为：camalexin1.0mM，scopoletin0.1mM，gossypol0.1mM；最佳用药方式为：24h内喷洒一次）后，再进行光暗转换，结果发现植保素预处理的flu幼苗白化率为10%左右，显著低于对照组的60%。其荧光定量结果显示，植保素预处理组幼苗的1O2标记基因表达量显著低于对照组，进一步验证了前期结论，植保素对1O2基因表达存在抑制作用。 为了探究植保素与单线态氧产生的关系，我们观察了暗处理恢复照光1h后，SSU-GFP/flu的叶绿体完整性，结果发现未经植保素预处理的对照组的SSU-GFP融合蛋白分散到细胞质中，叶绿体已经被破坏。经植保素预处理的拟南芥，SSU-GFP融合蛋白仍停留在叶绿体内，叶绿体完整性不受明显干扰。对光暗转换后的flu幼苗进行SOSG染色，发现经植保素预处理幼苗和未经植保素预处理的幼苗都产生了1O2，且1O2积累量没有显著性差异，这就表明植保素不影响flu幼苗中1O2的产生。 对flu成熟苗用最佳方式进行植保素预处理（最佳浓度为：camalexin1.0mM，scopoletin0.1mM，gossypol0.1mM；最佳用药方式为：48h内喷洒一次），然后进行8h黑暗16h光照转换，循环三次后恢复连续光照。结果发现，植保素预处理后的植株恢复连续光照7d后，茎长可恢复到在连续光照下生长5-6d的程度约150mm，显著高于对照组的60mm。对光暗循环处理三次的拟南芥叶片进行TBD染色观察其叶片细胞死亡情况，结果发现，植保素预处理后叶片细胞死亡情况明显低于对照组。对光暗循环后恢复光照的flu成熟苗在不同时间点取样，检测1O2标记基因的表达情况。结果发现，经植保素预处理的叶片，其1O2标记基因表达量显著低于对照组，该结果表明，植保素对1O2基因表达存在抑制作用，与幼苗中结果相符。植保素对SSU-GFP/flu成熟植株叶片叶绿体完整性的影响及flu成熟植株叶片中单线态氧产生的影响与幼苗的实验结果一致。 本研究初步证明了，植保素对1O2的基因表达存在抑制作用，使其保持在较低水平，进而减轻病害发展、叶片损伤，降低flu幼苗白化死亡率，缓解flu成熟苗的生长抑制，但植保素不影响1O2的产生。
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