摘要
花鲈（Lateolabrax maculatus），又名七星鲈，是我国的重要海水经济鱼类，在全国多地均有养殖，其中，以中国南方沿海地区为主要养殖区域。随着全球变暖的趋势日益严重，夏季高温引起的热应激已严重制约花鲈养殖业的可持续发展。因此，深入理解花鲈响应热应激的机制，对于花鲈健康养殖具有重要意义。为此，本研究以遗传背景一致的花鲈幼鱼作为试验对象，分别在适温（27℃，N）、中高温（31℃，M）及高温（35℃，H）三个温度处理下进行长期（56d）养殖，每个处理3个重复，每个重复40尾鱼。养殖结束后，通过测定生长、免疫、抗氧化等相关表观指标获得花鲈生理响应特征，构建花鲈响应长期高温胁迫的表观模型，然后利用转录组学和蛋白组学技术获得花鲈响应长期高温胁迫过程的主要调控通路，并在此基础上分析其潜在的调控机制。主要研究结果如下： 1.高温胁迫下花鲈的生理响应特征分析 为明确长期高温胁迫下花鲈生理层面的响应特征，对生长性能、饲料利用、全体组分、肝肾功能、组织结构、抗氧化能力、非特异性免疫能力和溶解氧利用能力等相关指标进行了测定与分析。结果发现，与N组相比，H组花鲈增重率（WGR）、存活率（SR）、摄食率（FI）和全体粗蛋白（CP）含量显著降低（P＜0.05），饲料系数（FCR）和全鱼粗脂肪（CL）含量显著升高（P＜0.05），肠道脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）和胰蛋白酶（TRY）活性显著降低（P＜0.05），且组织切片观察发现肠道绒毛破损，绒毛高度、宽度显著降低（P＜0.05），同时肠道促炎因子相关基因表达量显著升高（P＜0.05），表明长期高温胁迫抑制了花鲈的摄食和消化功能，诱导了能量代谢紊乱，降低了生长性能与存活率。H组花鲈血清谷丙转氨酶（AST）活性、谷草转氨酶（ALT）活性、肌酐（CREA）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）显著升高（P＜0.05），且组织切片观察发现肝脏出现空泡化现象，表明长期高温胁迫可能引发花鲈氧化应激，导致肝肾功能受损。H组花鲈头肾酸性磷酸酶（ACP）活性、碱性磷酸酶（AKP）活性、总一氧化氮合酶（T-NOS）活性、一氧化氮（NO）含量和全血呼吸爆发（RB）能力均显著降低（P＜0.05），表明长期高温胁迫可能导致花鲈非特异性免疫能力降低。H组花鲈血液中红细胞（RBC）数量显著下降（P＜0.05），且组织切片观察发现鳃小片顶端肿胀、卷曲，同时组织（肝脏、肠道、肾脏、鳃、肌肉、脑）中缺氧诱导因子1α（hif1α）基因表达量显著升高（P＜0.05），表明长期高温胁迫可能导致花鲈利用水体溶解氧能力降低，使花鲈处于缺氧状态。而M组与N组相比，M组花鲈在生长性能、饲料利用及抗氧化能力等方面均无显著变化（P＞0.05），表明在本实验条件下31℃未对花鲈造成显著的负面影响。综上，花鲈具有一定的耐高温能力，但长期35℃高温胁迫降低了花鲈利用溶解氧能力，破坏了肝脏、鳃及肠道的组织结构，抑制了摄食和消化，降低了非特异性免疫能力，诱导了氧化应激和能量代谢紊乱，最终导致花鲈生长缓慢和死亡率升高。 2.高温胁迫下花鲈肝脏转录组学及蛋白组学分析 为明确长期高温胁迫下花鲈分子层面的响应特征，本研究对3个温度处理下的肝脏组织进行了mRNA及蛋白质的变动和调控特征分析。结果发现，在mRNA水平上，随着温度的升高，差异基因的数目明显增加。M组与N组相比，上调的基因有58个，下调的有63个。H组与N组相比，上调的基因有388个，下调的基因有240个。在蛋白水平上，随着温度的升高，差异蛋白的数目明显增加。M组与N组相比，上调的蛋白有229个，下调的有187个。H组与N组相比，上调的蛋白有393个，下调的蛋白有655个。分别在mRNA水平及蛋白质水平上进行GO富集和KEGG富集发现，差异基因与差异蛋白功能主要与氧化磷酸化过程及氧化还原过程有关，其主要富集在蛋白质的加工合成通路、能量代谢通路及氧化还原通路上。随后对转录组数据及蛋白组数据进行联合分析，结果发现，花鲈肝脏在响应长期高温胁迫的生物过程中其分子表达受转录后修饰的调控，且差异表达分子的生物功能主要与能量代谢相关。综上，高温胁迫主要驱动了花鲈的热休克应答、氧化应激应答和能量代谢应答，且能量代谢相关通路可能在鲈肝脏响应长期高温胁迫的过程中发挥着重要的作用。 3.花鲈响应高温胁迫的主要通路分析 为明确长期高温胁迫下花鲈关键应答途径的潜在分子机制，本研究在上述基础上分析了热休克应答、氧化应激应答及能量代谢应答的分子调控特征。结果发现，高温胁迫诱导H组花鲈热应激，H组花鲈肝脏、肠道、肾脏、鳃、肌肉及脑组织中热休克蛋白的表达显著上调（P＜0.05），且以肝脏、肾脏及肌肉组织中热休克蛋白（HSP60、HSP70、HSP90）的表达量最高，其中hsp70的基因表达水平变化最为明显；高温胁迫诱导H组花鲈氧化应激，H组花鲈肝脏、肠道、肾脏、鳃及肌肉中MDA含量显著升高（P＜0.05），且以肝脏、肾脏及肌肉组织中MDA含量的变化最为明显，同时肝脏中nrf2及ho-1的基因表达量显著升高（P＜0.05），而keap1的基因表达量显著降低（P＜0.05），表明NRF2/KEAP1/HO-1信号通路参与机体应对高温胁迫抗氧化能力的调节；此外，高温胁迫诱导H组花鲈肝脏的能量代谢模式发生显著的改变，H组花鲈肝脏中脂肪分解相关基因cpt1与atgl的表达量显著降低（P＜0.05），脂肪合成相关基因fas、acc及内质网驻留蛋白srebp-1c的表达量显著升高（P＜0.05），表明线粒体β-氧化供能受到抑制，脂肪分解减少，脂肪合成增强且可能与内质网有关。H组花鲈肝脏中糖降解及糖异生相关酶PEPCK、G6Pase、HK、PFK、PK和LDH的活性显著升高（P＜0.05），糖原合成相关酶GYS和GBE的活性显著降低（P＜0.05），而GSK3β的活性显著升高，表明糖异生途径增强且糖原无氧酵解供能增加，同时抑制了糖原合成。H组花鲈肝脏中蛋白质分解相关基因atrogin1、murf1的表达量显著升高（P＜0.05），蛋白质合成相关基因pi3k、akt、mtor及s6k的表达量显著降低（P＜0.05），表明蛋白质可能分解增加生成游离氨基酸用于提供能量，同时降低了蛋白质的合成。综上，花鲈通过上调热休克蛋白的表达、提升抗氧化能力及转变能量代谢模式进行高温胁迫响应，然而在此过程中，热休克反应通过内质网参与能量代谢的改变，氧化应激反应通过线粒体参与能量代谢模式的改变，因此能量代谢相关通路可能是花鲈响应长期高温胁迫的关键通路，同时表明线粒体与内质网可能在高温导致的能量代谢紊乱过程中发挥重要作用。 4.线粒体与内质网在高温胁迫导致花鲈能量代谢紊乱中的作用 为明确花鲈肝细胞中线粒体与内质网在长期高温胁迫导致花鲈能量代谢紊乱中的作用，本研究对线粒体及内质网进行了结构及功能上的分析。结果发现，与N组相比，在结构上，H组花鲈肝脏线粒体膜损伤、嵴消失，形态结构异常；内质网片层结构断裂，排列混乱。在功能上，H组花鲈肝脏线粒体含量显著降低（P＜0.05），电子传递链相关蛋白复合物（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）的蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；内质网应激相关基因grp78、xbp1、perk、chop、atf6的表达量显著升高（P＜0.05），表明高温胁迫损伤了线粒体和内质网，抑制了线粒体氧化磷酸化能力，并导致内质网应激。与此同时，H组花鲈肝脏线粒体质控相关基因sirt1、pink1、parkin、mfn1b、mfn2及opa1的表达量显著降低（P＜0.05），而drp1的表达量显著升高（P＜0.05），内质网质控相关基因fam134b、sec62、atl3及calcoco1表达量显著升高（P＜0.05），表明高温胁迫下线粒体与内质网稳态失衡，造成了线粒体与内质网的功能障碍。综上，长期高温胁迫导致花鲈肝细胞线粒体与内质网结构受损、稳态失衡和功能障碍，这可能是高温导致花鲈能量代谢异常主要原因。 综上所述，长期高温胁迫改变了花鲈生理、生化状态及分子表达模式，影响花鲈的生存。简而言之，长期高温胁迫降低了花鲈利用水体溶解氧的能力，抑制了摄食与消化，破坏了机体的免疫与抗氧化能力，造成了肝脏、鳃及肠道组织损伤，并导致能量代谢紊乱，诱导脂肪异常沉积，最终导致花鲈生长缓慢和死亡率升高。其中，线粒体与内质网稳态失衡是长期高温胁迫损害鱼体健康的关键因素。本研究为开发高温期花鲈专用饲料提供理论基础，有助于花鲈养殖业健康可持续发展。
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