摘要
高脂饲料因其“蛋白质节约”效应而被广泛应用于水产养殖生产中，但长期使用高脂饲料容易诱发养殖鱼类的脂肪肝问题，严重危害了水产养殖业的健康发展。课题组前期研究结果发现，高脂饲料会导致线粒体结构的损伤及功能的障碍，进一步引发鱼类脂代谢紊乱导致脂肪的过度沉积。因此，调控鱼类线粒体功能可能是缓解脂肪肝的潜在手段。近年来，调控线粒体功能的天然物质引起了人们的广泛关注，提示可以通过营养手段调控线粒体功能从而缓解鱼类脂肪肝的发生。基于此，本研究旨在探究饲料中添加辅酶Q10对鱼类的生长、脂肪沉积、线粒体功能的调控与机制。相关研究结果如下： 1.辅酶Q10对花鲈生长、脂肪沉积的影响 本试验以花鲈作为研究对象，旨在探究辅酶Q10对高脂条件下花鲈生长和脂肪沉积的影响。分别制作了脂肪含量为11%的基础饲料（NFD）和脂肪含量为17%的高脂饲料（HFD），并在高脂饲料基础上分别添加 5、20 和 80 mg/kg的辅酶 Q10（COQ10），记为 HFD+COQ10-5、HFD+COQ10-20和HFD+COQ10-80。进行8周的养殖试验后，对样品进行采集和测定分析。研究结果表明，与NFD相比，HFD组花鲈的生长效率、饲料转化率和蛋白质利用率显著降低，腹脂率增加。然而，补充辅酶Q10之后，生长指标得到显著改善，并降低了腹脂率，且补充 80 mg/kg辅酶 Q10 的花鲈生长效果最好。此外，摄食 HFD 以后花鲈血清和肝脏中的甘油三酯及总胆固醇含量显著升高，而补充辅酶Q10明显降低了其含量。油红O染色结果也显示补充辅酶Q10减少了肝组织内的脂滴数量，并显著上调了脂肪分解相关基因的表达。对花鲈全体和肌肉营养组成测定表明，与NFD组相比，HFD组鱼体脂肪含量显著增加，但添加辅酶Q10对鱼体脂肪含量无显著影响。与NFD组相比，辅酶Q10添加组的肌肉脂肪含量显著增加，全鱼和肌肉的蛋白质、水分和灰分无显著性差异。综上所述，辅酶Q10显著缓解了花鲈摄食高脂所引起的生长性能下降与脂肪过度沉积。 2.辅酶Q10对花鲈肝脏线粒体功能的影响 HFD 摄食导致花鲈肝脏内 SOD、CAT 以及 GPX 等多种抗氧化酶的活性下降，同时MDA含量显著升高，这表明肝脏出现了氧化应激；而添加辅酶Q10后花鲈肝脏抗氧化酶活性提升，MDA水平降低。此外，HFD摄食导致花鲈肝脏内柠檬酸合酶（CS）、琥珀酸脱氢酶（SDH）以及苹果酸脱氢酶（MDH）等线粒体代谢酶活性降低，ATP生成减少，表明HFD影响了肝脏线粒体功能；而添加辅酶Q10逆转了以上的不利影响，表明辅酶Q10能够增强肝脏线粒体功能。对线粒体稳态相关基因表达的测定结果表明， HFD 组线粒体自噬基因pink1、mul1、atg5及线粒体生成相关基因pgc-1α、pgc-1β、nrf-1、tfam的表达水平均显著下调，而辅酶Q10可以上调这些基因的表达，说明辅酶Q10可能通过激活线粒体自噬而保护线粒体，详细机制有待进一步解析。 3.辅酶Q10调控花鲈肝脏线粒体功能的分子机制 为深入探讨辅酶Q10减轻肝脏脂肪沉积的作用机理，以花鲈肝脏细胞系为研究对象进行体外试验。利用油酸与棕榈酸（油酸∶棕榈酸=1∶1）制备混合脂肪酸（FA），以此建立肝细胞脂肪沉积模型；试验设定三个组：正常培养基作为对照组，含 100 μmol/L FA 的脂肪酸组（FA 组）以及 100 μmol/L FA 和 5 μmol/L辅酶 Q10 共同处理组（FA+COQ10 组）。细胞培养12h之后，进行细胞收集、测定和分析处理。研究结果表明，FA处理显著增加了细胞中甘油三酯含量，Bodipy染色后发现细胞内出现大量脂滴，而辅酶Q10降低了细胞中甘油三酯和脂滴的数量。同时，FA组的ALT、AST、LDH的活性显著升高，而FA+COQ10组的培养基中活性均降低。FA组细胞中ROS含量显著上升，辅酶Q10显著降低细胞ROS的含量。 为了验证辅酶Q10是通过清除ROS缓解肝脏损伤的，设置对照组、FA组、FA+COQ10、FA+NAC组（即用细胞ROS清除剂NAC预处理），发现清除活性氧后缓解了肝细胞损伤，线粒体膜电位也恢复正常。FA处理导致肝细胞线粒体代谢酶 CS 和 SDH活性降低、ATP含量减少、线粒体膜电位异常以及线粒体自噬水平下调。进一步分析发现，线粒体自噬关键基因pink、parkin、lc3b的表达显著下调，而p62表达水平则显著上调。通过线粒体荧光染色及mtDNA含量的检测发现，在FA处理的细胞中线粒体数量明显减少，而在FA+COQ10处理后线粒体数量显著增多。这表明辅酶Q10缓解了肝细胞内脂肪的沉积以及增强了线粒体功能，并且能显著促进线粒体自噬过程。为深入研究辅酶Q10增强线粒体功能是否与激活自噬有关，设置 FA 组、FA+COQ10 组和 FA+COQ10+Mdivi-1 组（线粒体自噬抑制剂Mdivi-1预处理）。使用Mtphagy Dye染色后发现，与FA+ COQ10组相比，FA+COQ10+Mdivi-1组的自噬小体数量降低，表明辅酶Q10激活线粒体自噬的作用被抑制了。本研究结果表明，辅酶Q10增强线粒体功能，缓解脂肪过度沉积依赖于PINK1介导的线粒体自噬。 综上所述，高脂饲料的投喂对花鲈的生长产生不利影响，导致肝脏脂肪过度沉积，同时伴有线粒体的损伤并影响其功能。辅酶Q10可增强线粒体功能，缓解高脂导致的花鲈生长性能下降与脂肪过度沉积；细胞试验进一步证实了辅酶Q10发挥作用是通过激活PINK1介导的线粒体自噬过程实现的，综合各项指标发现，添加 20 mg/kg辅酶 Q10 的效果最好。
NETL