摘要
L-苹果酸是一种四碳二元羧酸，广泛存在于天然果实中，因其独特的酸味口感和重要的生理作用，在食品、医药等领域应用广泛，市场需求巨大。传统的直接提取法、化学合成法、固定化细胞反应柱等方法存在得率低、反应条件苛刻、对映体拆分困难等问题。随着合成生物技术的发展，构建高效微生物细胞工厂，为实现L-苹果酸的绿色生物制造提供了可能。 本研究以食品安全级非模式黑曲霉工业菌株S916作为出发菌株，利用合成生物学技术，构建非柠檬酸积累底盘菌，随后通过分析L-苹果酸的合成代谢通路，通过构建L-苹果酸分泌模块、合成通量强化模块，提高L-苹果酸合成水平。本研究还对黑曲霉中的前体物质供给模块、全局性转录调控因子与L-苹果酸合成的影响进行了初步讨论。主要研究内容如下： （1）非柠檬酸积累底盘菌构建：敲除柠檬酸转运蛋白cexA基因，阻断柠檬酸的胞外转运，得到S1075菌株。L-苹果酸产量是S916菌株的1.8倍左右； （2）构建L-苹果酸分泌模块：在S1075菌株基础上，异源表达c4t318基因（米曲霉来源），增强L-苹果酸的胞外转运能力，获得菌株S1700。L-苹果酸产量相较于S1075提高57.2%左右； （3）强化合成通量模块：在S1700菌株基础上，先后过表达了自身来源的mdh和pyc基因，增强了rTCA合成途径，获得菌株S2080。L-苹果酸产量相较于S1700提高34.8%左右； （4）增强前体物质供给模块：在S2080菌株基础上，共过表达了糖酵解途径中自身来源的hxkA和pfkA基因，获得菌株S2388；同时，过表达了自身来源的mstC基因，获得菌株S2868；L-苹果酸的产量及产酸速率相较于S2080菌株均未出现明显变化； （5）探究全局调控因子的影响：在S2080菌株基础上，对全局调控因子veA进行了强化表达，获得菌株S2770；同时分别对laeA基因进行了敲除和过表达，分别获得菌株S2972和S3140；相较于S2080的L-苹果酸的产量，菌株S2770未出现明显变化；菌株S2972下降46.6%左右；菌株S3140下降21.5%左右； （6）探究丙酮酸转运的影响：在S2080菌株基础上，同时分别对自身来源的mpcA和mpcB基因进行了RNA干扰，分别获得菌株S2660和S2661，L-苹果酸产量相较于S2080，S2660菌株提高50.5%左右，S2661菌株下降14.6%左右。 通过合成生物学技术改造后，获得一株具备工业化应用潜力的L-苹果酸细胞工厂菌株S2660，发酵摇瓶72h的产量最高达到71.74g/L，较出发菌株S916发酵摇瓶96h产量提高5.9倍，72h时的平均生产效率可达到0.996g/L/h。该菌株较模式菌株具有发酵周期短、产孢能力强、副产物少等优势，能够有效的节约时间及工业化生产成本。
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