摘要
雌激素作为重要的类固醇激素自发现至今一直是生物学领域的研究热点，其中雌二醇（17β-estradiol，E2）作为雌激素的主要形式被证实广泛参与调控雌性哺乳动物发情周期、卵巢发育、卵泡成熟和排卵等众多重要的生理过程。研究证实卵巢颗粒细胞中E2合成异常可引起卵泡闭锁、卵泡发育受阻和排卵异常，甚至导致不孕不育的发生，最终影响雌性哺乳动物繁殖潜能的发挥。目前关于畜禽卵巢颗粒细胞中E2合成调控机制的研究较多，但受长链非编码RNAs（lncRNAs）调控机制的研究较少。实验室前期鉴定了一个在猪卵巢组织中特异性高表达的lncRNA，即lncRNA NORFA，本研究利用高通量技术发现其可能参与调控猪卵巢颗粒细胞E2合成。因此，本文拟在前期研究的基础上，继续以NORFA为研究对象，分析NORFA对猪卵巢颗粒细胞中E2合成的调控作用及其分子机制。该研究不仅为解析猪卵巢颗粒细胞E2合成的表观遗传调控机制提供理论依据，同时也是对筛选影响母猪繁殖力的内源性小分子调节物的有益尝试。 全文的主要研究结果如下： 1.NORFA是猪卵巢颗粒细胞中潜在的E2合成调控因子 利用转录组测序（RNA-seq）技术发现，干扰内源性NORFA可导致猪卵巢颗粒细胞中1 167个基因表达发生显著变化（P＜0.05）（其中787个基因表达显著上调，380个基因表达显著下调），包括965个功能已知和202个功能未知的基因。选择功能已知的基因进行基因功能富集（GO）分析，共鉴定了88个显著富集的GO条目（P＜0.05），涵盖45个生物过程（BP）、23个细胞成分（CC）以及20个分子功能（MF）。KEGG信号通路富集分析发现，差异表达基因显著富集在与细胞状态和功能调控的相关信号通路中（P＜0.05），如PI3K-Akt、TGF-β、MAPK和雌激素合成等信号通路。选择12个差异表达基因（6个上调和6个下调）进行qRT-PCR验证，结果与测序数据相符，表明本研究中的测序结果具有较高的准确性。转录组结果表明干扰NORFA可影响猪卵巢颗粒细胞中E2合成通路中关键基因的表达，是E2合成的潜在调控因子。 2.NORFA通过促进CYP11A1表达诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成 相关性分析发现猪卵泡中NORFA表达水平与卵泡液中E2分泌水平呈极显著正相关（r=0.7968，P=0.0002）。在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，NORFA可显著诱导E2的合成与分泌（P＜0.05）。有趣的是，卵巢颗粒细胞中E2合成通路中第一步关键限速酶P450scc的编码基因CYP11A1是干扰NORFA的差异表达基因，并证实NORFA可显著上调CYP11A1的mRNA与蛋白水平（P＜0.05）。相关性分析发现NORFA与CYP11A1在猪卵巢颗粒细胞中的表达水平呈极显著正相关（r=0.6331，P=0.0085）。进一步分析发现NORFA可诱导P450scc催化和裂解的产物孕烯醇酮（Pregnenolone，PREG）的生成。另外，共转试验发现CYP11A1特异性小干扰RNA处理可显著抑制NORFA过表达对猪卵巢颗粒细胞中E2合成的促进作用（P＜0.05）。综上表明NORFA可通过上调CYP11A1的表达促进猪卵巢颗粒细胞中E2合成。 3.NORFA通过上调NR5A1表达与转录因子活性促进CYP11A1转录 荧光素酶活性试验发现NORFA可促进猪卵巢颗粒细胞中CYP11A1启动子转录活性。结合RNA-seq数据与JASPAR数据库分析结果表明转录因子NR5A1可能介导NORFA对CYP11A1的转录调控。序列分析发现猪CYP11A1启动子上包含一个潜在的NR5A1结合位点，随后利用染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶活性试验等证实NR5A1作为转录因子可与CYP11A1启动子区直接结合，进而促进后者在猪卵巢颗粒细胞中的转录。干扰内源性NORFA可显著抑制猪卵巢颗粒细胞中NR5A1的表达水平（P＜0.05）。相关性分析发现猪卵泡中NORFA与NR5A1表达水平呈显著正相关（r=0.5335，P=0.0494）。另外，干扰NORFA可显著抑制转录因子NR5A1在CYP11A1启动子上的结合丰度（P＜0.05），而过表达NR5A1可挽救干扰内源性NORFA对CYP11A1启动子活性与转录的抑制作用。上述结果表明NORFA通过上调转录因子NR5A1的表达激活猪卵巢颗粒细胞中CYP11A1的转录。 4.NORFA通过NR5A1/CYP11A1轴诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成 为了分析NORFA/NR5A1/CYP11A1通路对猪卵巢颗粒细胞中E2合成的调控作用，本文采用ELISA法检测不同处理条件下猪卵巢颗粒细胞培养基中E2浓度。结果发现转录因子NR5A1过表达可极显著诱导体外培养培养颗粒细胞E2合成，而干扰内源性CYP11A1可极显著抑制转录因子NR5A1过表达对E2合成的诱导作用（P＜0.01），说明NR5A1/CYP11A1轴可诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成。另外，NR5A1过表达还可挽救干扰内源性NORFA对猪卵巢颗粒细胞中E2合成的抑制作用（P＜0.01），说明NORFA可通过转录因子NR5A1诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成。上述结果表明NORFA可通过NR5A1/CYP11A1轴诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成。 综上所述，本文构建了NORFA干扰对猪卵巢颗粒细胞转录组表达谱，证实了NORFA是猪卵巢颗粒细胞中E2合成的新型诱导剂，揭示了NORFA通过促进NR5A1的表达与转录因子活性激活CYP11A1基因转录，进而诱导猪卵巢颗粒细胞中E2合成的机制。
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