摘要
番茄具有极高的营养价值和经济价值，是三大世界性贸易蔬菜之一，在全球蔬菜贸易中占有重要的地位。番茄晚疫病是一种由致病疫霉引起的毁灭性病害，严重时可导致番茄毁种绝收。近年来研究发现，ROP蛋白（Rho-related GTPases）在植物防卫反应建立过程中具有重要作用。因此，本研究对番茄ROP家族（SlROPs）进行分类研究及蛋白质理化特性分析，并基于转录组数据挖掘番茄中抗致病疫霉相关抗病基因，继而对SlROPs在抗致病疫霉过程中的功能进行初步探索，研究结果将为番茄抗性育种提供理论参考。试验结果如下： （1）本研究对9个SlROPs进行了预测分析，结果显示9个SlROPs都只有一个Rho功能域；9个SlROPs的核苷酸序列相似度为73.97%；理化性质分析结果显示，SlROP蛋白长度介于197 ~211 aa之间；蛋白分子量介于21 463.75~23 587.2 Da；9个SlROPs蛋白均为碱性亲水蛋白。1个SlR OP蛋白可定位于细胞质，其余8个SlROPs蛋白均可定位于细胞膜、细胞质和细胞核；9个SlROPs蛋白均不具有信号肽和跨膜结构域。蛋白结构分析结果显示，SlROPs蛋白的二级结构以无规则卷曲和 α 螺旋为主，三级结构预测质量较好。通过系统进化关系发现9个SlROPs分为了4个分支，其中第Ⅰ、Ⅲ分支包括1个SlROP蛋白，第 Ⅱ 分支包括3个SlROPs蛋白，第Ⅳ分支包括4个SlRO Ps蛋白；9个SlROPs基因分布在1号、2号、3号、7号和12染色体上，其中2号染色上的SlROP s基因最多有3个，7号和12号染色体上的SlROPs基因最少有一个。 （2）本试验采用离体叶片接种法将致病疫霉孢子悬浮液喷雾接种于番茄叶片，其中无菌水处理的叶片作为对照组，于接菌0、3、6、12、24、36、48和60hpi 这8个时间点收集样本进行转录组测序。在8个比较组中均出现了基因的差异表达，其中60hpi中差异表达基因最多为1 1948，上调基因5422个，下调基因6526个。通过对所有比较组中的差异基因进行GO和KEGG富集分析，我们在与植物抗病有关的通路中（防御响应、卵菌防御响应、植物激素信号转导、植物-病原体相互作用、MAPK信号通路和GTP结合蛋白等）对番茄响应致病疫霉的基因进行了挖掘，发现富集在这些通路中的差异基因被注释为WRKY转录因子、钙调蛋白、离子通道蛋白、LRR受体蛋白激酶、MA PKKK、受体激酶、受体蛋白和ROP蛋白等。SlROP是一类番茄响应致病疫霉侵染的重要基因，在本研究中我们从转录组数据中提取了9个SlROP基因的表达数据进行了表达谱分析，其中第Ⅰ和Ⅲ分支表达量上调，第Ⅱ和Ⅳ分支表达量下调，且同一进化分支的表达谱一致。 （3）通过病毒介导的基因沉默技术同时对9个SlROPs基因进行了基因沉默，其中GUS处理作为对照组；随后采用游动孢子悬浮液液滴法对沉默株系的抗病性进行了鉴定，结果表明接种4天后沉默株系病斑面积显著小于对照组的病斑面积。最后，利用试剂盒的方法对沉默株系和对照组接种致病疫霉不同时间点（0、3、6、12、24、36、48和60hpi）的防御酶活性和胼胝质含量进行了测定，其中防御酶包括CAT（过氧化氢酶）、POD（过氧化物酶）和SOD（超氧化物歧化酶），结果显示沉默株系中CAT、POD和SOD的酶活性在0hpi均高于对照株系，POD和SOD的能更快的响应病原菌的侵染；沉默株系中胼胝质含量在0hpi是对照株系的7.48倍，在沉默株系中除60hpi外其他时间的的胼胝质含量均高于对照组，说明胼胝质在番茄应答晚疫病菌中起到了重要作用。综上所述，S lROPs可能是通过调控防御酶活性和胼胝质沉积进而调控番茄对致病疫霉的抗性建立过程。
NETL