摘要
宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，已成为危害女性健康的最常见癌症之一。近年来，宫颈癌发病率逐年增加，并呈现年轻化趋势。人乳头瘤病毒(Humanpapilloma-virus,HPV)持续性感染被认为是诱发宫颈癌病变的重要因素。据统计，80％女性会受到HPV的感染，但绝大部分感染属于一过性感染，仅有少部分高危型HPV未被完全清除，长期的高危型HPV感染极大地增加了宫颈癌诱发的风险。高危型HPV16和HPV18是HPV中两种最常见的病毒亚型，与70％以上宫颈癌患者的感染相关。因此，及时对患者进行HPV检测，对宫颈癌的预防和治疗意义重大。目前，针对HPV的检测方法虽具有一定的敏感性和特异性，但在实际检测中存在一定的误差。例如，在HPVDNA检测中，因“一过性感染”导致“假阳性”结果;在HPVmRNA检测中，因mRNA的性质不稳定而导致“假阴性”结果。因此，临床检测HPV的准确性有待于进一步提高。纳米抗体(Nanobody，Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体，具有分子量小、组织穿透性高、特异性强和识别隐性抗原表位等优势，已被广泛应用于疾病诊断、治疗和肿瘤成像等方面。本论文利用大肠杆菌表达系统获得HPV16和HPV18的E6/E7重组蛋白，并以这四种重组蛋白作为抗原，利用噬菌体展示技术分别从纳米抗体合成文库中进行多轮生物淘选，并通过Phage-ELISA筛选和鉴定获得特异性纳米抗体，以期建立一种灵敏度高、特异性强的针对高危亚型HPV16/18的检测方法。本论文研究的主要内容及实验结果如下: (1)构建HPV16/18E6/E7原核表达质粒，利用大肠杆菌表达系统进行HPV16/18E6/E7重组蛋白的表达。通过IPTG诱导、超声破碎和Ni-NTA亲和层析纯化成功获得重组蛋白，经SDS-PAGE分析表明四种重组蛋白均以可溶性形式表达，将纯化透析后的蛋白溶液使用10kDa超滤管进行浓缩，经Bradford试剂盒检测，四种重组蛋白的浓度均在0.3mg/mL以上，满足后续筛选需求。 (2)以HPV16/18E6/E7重组蛋白作为抗原，利用噬菌体展示技术分别从纳米抗体合成文库中进行三轮富集淘选，并通过Phage-ELISA对淘选后的细菌文库进行筛选和鉴定。经三轮富集淘选后，HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7富集倍数均达到了100倍以上，而HPV16E6的富集倍数较低。经过Phage-ELISA筛选鉴定和测序，HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7分别获得5条、2条和4条不同的纳米抗体序列。 (3)利用大肠杆菌表达系统对筛选出的HPV16E7特异性纳米抗体16E7-Nb4进行可溶表达和纯化，经Bradford试剂盒检测，16E7-Nb4浓度为0.25mg/mL,为进一步探究HPV16E7与16E7-Nb4的结合能力奠定了基础。 综上所述，本研究利用大肠杆菌原核表达系统成功获得了HPV16和HPV18E6/E7重组蛋白，通过噬菌体展示技术和Phage-ELISA筛选，鉴定出11条特异性纳米抗体序列，为进一步开发一种快速灵敏、特异性较强的针对高危型HPV16/18检测的纳米抗体诊断工具提供了相关参考。
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