摘要
雪茄烟叶工业发酵是雪茄加工工艺的重要环节。烟叶发酵过程中，在微生物和烟叶内源酶系的作用下烟叶发生着一系列生化反应，包括多糖等大分子物质降解、香气前体物裂解、不良风味物质转化等，进而改善雪茄的吸食品质。受种植产地、风土条件和环境因素影响，国产雪茄与进口优质雪茄烟叶相比，在感官品质方面存在香气质差，杂气、苦味重，刺激性大等问题。因此，利用国产雪茄烟叶生产优质雪茄烟，对雪茄烟叶工业发酵技术提出了更高要求。本文围绕国产（海南）雪茄烟叶工业发酵阶段开展研究:分析了不同发酵阶段（回潮前、发酵初期、发酵中期和发酵末期）雪茄烟叶挥发性与非挥发性成分的组成与变化;探究了发酵过程中雪茄烟叶中关键酶蛋白质的功能;解析了发酵过程中微生物群落结构和功能，并建立了微生物组与风味物质组的关系模型，为国产雪茄烟叶技术创新提供参考。主要研究内容即结论如下: 1.国产雪茄烟叶发酵过程中烟叶成分分析。采用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱技术，分析确认出对烟叶风味有直接影响或潜在影响的97种挥发性成分（正反匹配值大于800）,按化合物结构特点将其分为11类，各类化合物的相对质量分数变化存在显著性差异（P＜0.05）,不良挥发性成分16种，分别为刺激性（5种）、苦味（10种）、青杂气（2种）;结合分子对接技术进一步鉴定，并确定烟碱和麦斯明是对不良挥发性成分贡献较大的化合物，其它物质对不良风味具有辅助作用。分析认定了雪茄烟叶26种香气成分，其中正辛醛、甲基庚烯酮、苯乙酮、茄酮、大马士酮、香叶基丙酮和β-紫罗兰酮为关键的香气成分。通过非靶向代谢组学技术对雪茄烟叶非挥发性成分进行分析，检测到2702个化合物特征离子，根据对雪茄抽吸品质具有影响的差异非挥发性成分（化合物本身和前体物）进行筛选，筛选出76种差异非挥发性成分，38种非挥发性成分在发酵开始后相对含量下降，其中氨基酸及其衍生物占21种，氨基酸可以参与美拉德反应等转化成诸多香气成分从而影响烟叶抽吸品质。 2.雪茄烟叶发酵过程中蛋白质组学分析。国产雪茄烟叶发酵过程蛋白质组分析显示差异表达蛋白共1798个，发酵中期与回潮前烟叶差异表达蛋白数量最多，为1066个;发酵末期与发酵中期之间的差异表达蛋白数量最少，为90个。利用K-means均值聚类方法将1798个差异表达蛋白聚为10类，回潮前烟叶差异表达蛋白的高表达蛋白最多。每一类差异表达蛋白GO（GeneOntology）项的生物功能分析显示雪茄烟叶在不同发酵时期表现出不同的生物学特性，回潮前烟叶蛋白质主要富集的GO项参与含吡啶类化合物的代谢、氨基酸的代谢、单羧酸的运输与代谢;发酵前期主要参与跨膜运输与代谢活动。发酵中期主要为氨基酸与糖代谢以及蛋白质功能的维持，发酵末期主要富集的GO项参与维持蛋白质的生物功能,物质的跨膜运输和酰胺的生物合成与代谢。根据蛋白质注释的结果筛选出具有关键功能的蛋白质8种，如大麻二酚酸合酶样与烟碱的形成有关、叶绿素酶促进叶绿素的水解、漆酶促进烟叶木质素降解等。此外，根据蛋白质注释结果还筛选出氨基酸相关的蛋白质98种，其中8种氨基酸与21种驱动蛋白有显著相关性。 3.雪茄烟叶发酵过程中微生物组学分析。α多样性分析表明细菌菌群多样性和群落物种均匀度随发酵时间的延长逐渐升高又降低，真菌菌群多样性和群落物种均匀度逐渐降低。β多样性分析表明，在相对丰度大于1％的情况下细菌群落有12个门，真菌群落有2个门;细菌群落有10个属，真菌5个属。其中优势细菌属有7个，包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、GpI菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和气球菌属(Aerococcus);优势真菌属4个，包括曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、节担菌属(Wallemia)和匍柄霉属(Stemphylium)。属水平优势微生物与不良挥发性成分之间关联性解析显示，细菌中海洋芽孢杆菌属和可替宁、新烟草碱，土地芽孢杆菌属、气球菌属和Atopococcus菌属和乙酰胺等苦味挥发性成分呈正相关;GpI菌属与新烟草碱和假单胞菌属与壬醛等刺激性、青杂气挥发性成分呈正相关;真菌中枝孢属与匍柄霉属与三种不良挥发性成分具有显著相关性。匍柄霉属对癸醛、茄酮和对甲基苯甲醛和青霉属对乙苯、1，2,4,5-四甲苯和丙烯酸丁酯的产生具有显著正相关性，棒状杆菌属对二氢猕猴桃内酯和糠醛具有显著正相关性，对正辛醛、茄酮和对甲基苯甲醛具有显著负相关性，而癸醛与土地芽孢杆菌属、气球菌属和Atopococcus菌属显著负相关，与假单胞菌属和匍柄霉属显著正相关。 本文通过解读国产雪茄烟叶发酵过程中风味物质变化、构建蛋白质结构组成与表达和微生物组动态变化以及与风味物质的模型，加深了对国产雪茄烟叶发酵过程机理的认知。结合本研究试验结论，并在后续的研究中，将为海南雪茄烟叶关键功能酶和关键功能微生物筛选、醇化和应用提供指导。
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