摘要
伏马毒素是由串珠镰刀菌产生的一类水溶性霉菌毒素，其中污染最为广泛，毒性最强是Fumonisin B1(FB1)。随着畜禽养殖业的快速发展，相应的动物饲料以及原料的供应需求也日渐提高，玉米、高粱等作为饲料原料的农作物由于储存加工运输等过程中温度和湿度等条件的不成熟，极易受到伏马毒素的污染。动物被饲喂或误食毒素污染的饲料或农产品，会对其机体产生极大危害，极大影响畜牧业的发展。FB1的毒性作用在不同动物有不同的表现，猪作为最易受FB1侵袭的主要动物之一，主要引起严重的肺水肿和肝、肾损伤等，而造成的肺泡巨噬细胞吞噬能力降低和肺毛细血管内皮细胞中物质的积累是猪或者某些细胞类型所特有的。FB1在结构上类似于二氢鞘氨醇(SA)和鞘氨醇(SO),因此可能通过破坏神经鞘脂类生物合成与代谢途径，进而发挥毒性作用，诱导细胞凋亡、自噬、氧化应激和线粒体损伤等。虽然目前有研究表明FB1诱导溶酶体膜的不完整，但SO作为促溶酶体洗涤剂，FB1发挥细胞毒性是否与SO和SA作用类似，对溶酶体造成何种损伤尚不清楚。因此，本研究以PK15和3D4/21细胞作为实验材料，探究溶酶体膜透化在FB1诱导细胞毒性中的作用，并与SO和SA比较，深入探究溶酶体膜透化发生机制，通过筛选分析特殊溶酶体类群进一步阐明FB1对溶酶体的影响。主要研究内容包括以下两个方面： 为了探究FB1、SO和SA对细胞的毒性作用和溶酶体的影响，通过检测细胞活性，细胞凋亡等相关指标，综合评估FB1、SO和SA诱导的细胞凋亡。使用共聚焦显微镜检测溶酶体状态及分布，免疫荧光观察Cathepsin B(CTSB)和Galectin-3(Gal-3)蛋白的亚细胞分布，同时分离溶酶体和细胞质组分，蛋白免疫印迹检测组织蛋白酶的泄漏情况。检测线粒体膜电位和线粒体形态学变化来分析凋亡途径。随后为了探究FB1、SO和SA诱导溶酶体膜透化的作用机制，使用组织蛋白酶抑制剂Aloxistatin(E64D)分析溶酶体膜透化在细胞毒性中的作用。使用抑制剂Bafilomycin A1(BafA1)和N-acetyl-L-cysteine(NAC)，从溶酶体内部因素溶酶体pH和体积，外部因素活性氧(ROS)探究溶酶体膜透化的发生机制。最后使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1抑制线粒体分裂过程中释放的ROS,分析溶酶体膜透化与线粒体的关系。结果表明，FB1、SO和SA对PK15和3D4/21细胞均有细胞毒性，并显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，caspase 3和caspase 8剪切增多。吖啶橙结果表明溶酶体损伤，但FB1与SO和SA诱导的溶酶体体积和分布有所差别。在12h时，FB1、SO和SA即可诱导CTSB蛋白的泄漏以及Gal-3蛋白的点状聚集。同时，蛋白免疫印迹结果显示，细胞质组分中检测到CTSB和CTSD，说明FB1、SO和SA诱导溶酶体膜透化的发生。线粒体形态学显示了线粒体网络的破坏以及线粒体碎片化的发生，此外，FB1还诱导了线粒体膜电位的丧失以及细胞色素C的释放。这些结果表明，FB1、SO和SA诱导溶酶体膜透化，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。E64D缓解了FB1、SO和SA的细胞毒性，但对溶酶体分布没有影响，其次，E64D的使用可以缓解FB1诱导的细胞凋亡，说明溶酶体膜透化在FB1诱导的细胞凋亡中起重要作用。BafA1降低溶酶体酸性程度，增大溶酶体体积，加剧了FB1、SO和SA诱导CTSB的泄漏和Gal-3的聚集，即BafA1加剧了FB1、SO和SA诱导的溶酶体膜透化。值得注意的是，NAC清除细胞内ROS后可以缓解FB1诱导的溶酶体膜透化，但对SO和SA诱导的溶酶体膜透化没有作用。最后抑制线粒体分裂后，也能够缓解FB1诱导的溶酶体膜透化。这些结果表明，溶酶体膜透化是FB1诱导细胞凋亡的主要因素，与SO和SA不同的是，线粒体分裂或损伤产生的ROS介导了FB1诱导的溶酶体膜透化。 为了探究ROS和溶酶体分布位置的关系，使用Hyper7标记细胞内过氧化氢(H2O2)，为了探究FB1对溶酶体类群的影响，采用活细胞成像和3D surface分析溶酶体体积，酸性程度和分布位置。根据溶酶体体积大小和酸性程度强弱筛选出四个类群，根据与线粒体共定位情况筛选出两个类群，根据与细胞核距离筛选出两个类群，并对其进行交叉筛选后，详细分析FB1对哪些特殊类群溶酶体有影响。结果表明，H2O2主要分布于核周区域，FB1诱导溶酶体分布与H2O2分布区域高度一致。FB1整体增加了溶酶体体积和酸性程度，造成溶酶体累积。FB1并不能增加线粒体亚细胞区域中的溶酶体数量，非线粒体亚细胞区域内的溶酶体比线粒体亚细胞区域内的溶酶体状态更加稳定，而在FB1影响下，线粒体亚细胞区域内溶酶体体积波动较大。外周区域内溶酶体比核周区域内溶酶体状态更加稳定，在核周区域内溶酶体类群中，大体积和酸性程度强类群溶酶体更易受FB1影响。 综上所述，FB1与SO和SA类似，均有细胞毒性，诱导溶酶体膜透化，线粒体损伤和细胞凋亡。不同的是，FB1诱导的溶酶体膜透化现象主要由ROS引起或介导。FB1诱导溶酶体核周区域累积，并增加体积，使其更易受ROS侵害诱导溶酶体膜透化，与溶酶体酸性程度无关。总之，本研究表明FB1的毒性作用与其诱导各个溶酶体类群的分布相关，并由ROS介导溶酶体膜透化的发生。这些结果为了解细胞器之间的相互作用以及FB1毒性的机制提供了见解，对未来的治疗策略具有潜在意义。
NETL