摘要
鸡呼肠孤病毒在全球各国养鸡场均有发生，不同品种鸡均可感染，且发病季节不受限制，以白羽肉鸡发病最为明显，该病毒通过水平方式和垂直方式进行传播，患病鸡通常表现为精神沉郁，饮食下降，跗关节肿胀、跛行;剖检可见关节腔有渗出物，腱鞘出血水肿。近年来，我国ARV感染发病率在我国持续上升，且不断变异，传统呼肠孤病毒疫苗已不能有效控制当前流行的ARV,为控制鸡呼肠孤病毒病的发生，保护和促进养鸡业的健康发展，加强对呼肠孤病毒变异毒株疫苗的研究具有重要意义，本研究以ARV-LY383变异株为疫苗株研制油乳剂灭活疫苗，并进行疫苗免疫效力评估。具体研究内容如下: 1.鸡呼肠孤病毒ARV-LY383株扩繁 选取ARV-LY383株为疫苗株进行增殖，将纯净病毒液接种于生长状态良好的LMH细胞，将接毒后的LMH细胞放置37℃、5％CO2的温箱内培养24～48 h,待LMH细胞出现合胞体病变且病变率达90％以上时收毒，反复冻融三次确保瓶壁上的细胞完全脱落。对增殖的病毒液进行病毒细胞半数致死量（TCID50）测定和动物回归试验。结果:扩增病毒液TCID50=10-7.5/0.1mL,将扩增后的病毒液（TCID50=10-7.5/0.1mL）通过脚垫接种49日龄SPF鸡，其结果为观察期内SPF鸡脚垫肿胀且不消退。 2.鸡呼肠孤病毒最佳攻毒剂量和最佳攻毒途径筛选 将49日龄SPF鸡50只平均分为5组，每组10只，设置A、B、C、D、E五组，其中A～D组为不同攻毒剂量组，E组为对照组，进行最佳攻毒剂量试验。A组攻毒剂量为3×107.5TCID50;B组攻毒剂量为3×106 5TCID50;C组攻毒剂量为3×105.5TCID50;D组攻毒剂量为3×104 5TCID50;E组为对照组，接种等量生理盐水。连续10 d观察攻毒后SPF鸡的精神、采食情况，是否出现临床症状，并做好记录。试验结果显示:A组（攻毒剂量为3×107.5TCID50）对49日龄SPF鸡致病力最优，攻毒后1 d便出现脚垫肿胀且观察期内不消除，发病率保持在90％以上。最佳攻毒途径试验选择40只49日龄SPF鸡，平均分为四组，记为A～D组。A组攻毒途径为脚垫注射攻毒;B组攻毒途径为肌肉注射攻毒;C组攻毒途径为静脉注射攻毒;D组攻毒途径为口服攻毒，攻毒剂量均为3×107.5TCID50。连续观察10d并记录病变情况，观察期内每间隔3d记录一次SPF鸡的体重。结果:A组（脚垫注射攻毒）SPF鸡体重增长最为缓慢，攻毒后1 d脚垫肿胀率达到90％，直至观察期结束脚垫肿胀率仍在90％以上。 3.鸡呼肠孤病毒灭活疫苗制备 选用甲醛溶液作为抗原液灭活剂，在37℃温度条件下设置0.05％、0.1％、0.15％、0.2％四种不同的灭活浓度，同时每个灭活浓度设置12、24、36及48 h四种不同的灭活时间，以确定最佳灭活浓度和最佳灭活时间。结果表明，0.2％甲醛37℃灭活24 h能够将抗原液完全灭活，将灭活后的抗原液接种LMH细胞并盲传两代，细胞稳定增殖且无合胞体病变。 选择Tween-80与完全灭活并浓缩后的病毒液按照96∶4比例均匀混合制备疫苗水相，直至液体呈现淡黄色透明状。选择10号药用白油与Span-80以同样的比例高速混匀直至吐温溶解以制备油相。水相、油相按照1∶2的比例进行乳化，慢速搅拌油相的同时缓慢加入水相，持续搅拌至水、油相完全混合，直至疫苗呈均质状态。 4.鸡呼肠孤病毒灭活疫苗质量检验及免疫效果评价 （1）.无菌检验 制备的灭活苗接种于硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）、酪胨琼脂培养基（CA）、胰酪大豆胨培养基（TSB）内，放置37℃温箱培养7 d。培养基内无细菌生长，疫苗未被污染。 （2）.物理性状检验 对疫苗性状和稳定性进行检测，结果:疫苗在3,000 r/min,离心15 min条件下未出现分层破乳现象，稳定性良好。将此疫苗滴入冷水表面，疫苗不分散，故为油包水型疫苗。 （3）.安全性检验 将制备的灭活苗经颈背部皮下接种7日龄SPF鸡，连续10 d观察接种疫苗部位。结果:接种疫苗部位未出现红肿、破溃现象，经疫苗接种的SPF鸡并未出现饮食下降，卧地、不愿走动的现象。 （4）.保存期检验 在37、4℃两种不同温度条件下进行保存期实验，连续观察8个月。结果发现4℃条件下保存的疫苗性状稳定，未发生变质，疫苗效力不受影响，可以长期保存。 （5）.鸡呼肠孤病毒灭活疫苗免疫效果评价 筛选最佳免疫剂量，选取生长状态良好的21日龄SPF鸡50只，平均分为5组，每组10只。设置A、B、C、D、E组，其中A～D组为免疫接种组，免疫剂量分别为1、0.5、0.25和0.15 mL;E组为对照组，接种等量生理盐水。每间隔7 d采血一次，分离血清进行ELSA试验，检测抗体效价。疫苗免疫后28 d进行脚垫攻毒（3×107.5TCID50）,连续观察攻毒后SPF鸡的精神、饮食状况以及脚垫肿胀情况。结果显示:0.5mL（B组）免疫接种SPF鸡可达到较好的免疫效果，免疫保护率在90％以上。免疫攻毒保护试验验结果显示0.5 mL免疫组的肠道、法氏囊仅有轻微病变。免疫保护持续期实验表明，接种疫苗第二周实验鸡抗体水平开始增长，免疫后第四周达到较高水平，OD450平均值在1.581且免疫效价几何平均值达到13782;接种疫苗后第八周，抗体仍维持在较高水平且免疫保护率不受影响。 根据以上试验结果可得，本次研究所制备的鸡呼肠孤病毒灭活疫苗能够高效防止ARV感染，疫苗安全无害，不会妨碍接种鸡的正常生长，为我国防治鸡呼肠孤病毒感染提供了方便快捷的生物制品。
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