摘要
本课题组前期研究发现，临床常用补肾中药仙茅、淫羊藿二者合用，能有效地缓解Aβ1-42诱导的轻度阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)模型和脂多糖(LPS)诱导的认知障碍模型脑内的炎性反应。然而，仙茅和淫羊藿水提物(The aqueous extracts of Curculiginis Rhizomaand Epimedii Folium,CREF)改善AD的物质基础和作用机制仍需要进一步深入研究。 网络药理学已广泛应用于中医药领域，用于筛选中药活性成分和研究作用机制。然而，由于目前中药数据库缺乏质控、参数追溯等原因，导致筛选出的关键成分出现异常同质化现象。但是，基于气质联用、液质联用等技术筛选出的关键成分则不存在同质化问题。 中药配伍机制是中药现代化的难题之一，研究疾病状态下中药在体内的过程更具有临床意义。中药多成分药动学可以明确多种主要活性成分在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄特征，有助于研究中药配伍机制和疾病状态下中药的体内过程。 目的: 基于“入血成分-作用靶标-关键通路”分析方法，鉴定CREF给药后的原型入血成分、预测其作用靶标，并研究CREF主要活性成分在不同状态下的药动学差异，为CREF的药效物质基础、配伍机制及临床前研究提供科学依据。 方法: 第一部分，原型成分鉴定。采用超高效液相色谱联用线性离子阱/静电场轨道阱高分辨率质谱(UPLC-LTQ/OrbitrapMS)技术鉴定CREF的化学成分和原型入血成分。 第二部分，作用机制预测。基于“入血成分-作用靶标-关键通路”策略，利用网络药理学和分子对接预测CREF改善轻度AD的作用机制。 第三部分，药动学研究。建立CREF中7种化学成分的大鼠血浆样品定量分析方法，比较CREF中仙茅和淫羊藿配伍前后的药动学差异;建立Aβ1-42诱导的认知障碍模型，研究正常和病理状态下CREF的药动学差异。 结果: 第一部分，原型成分鉴定。CREF中共鉴定出18种成分，灌胃给药后大鼠血清中发现12种原型成分（包括仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2"-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、箭藿苷A、箭藿苷B和宝藿苷I、木兰花碱、淫羊藿素）。 第二部分，作用机制预测。CREF改善轻度AD可能的作用靶点为MAPK3,TNF,Aktl,涉及MAPK、PI3K/Akt和钙离子等信号通路，分子对接实验证明成分和靶点间具有良好结合活性。 第三部分，药动学研究。（1）CREF中7种成分的大鼠血浆样品分析方法经方法学验证，能够满足生物样品分析的要求。仙茅水提物（CR）、淫羊藿水提物（EF）和CREF的药动学实验结果表明，与CR组相比，CREF中苔黑酚葡萄糖苷的Cmax以及仙茅苷的Cmax和AUC0-∞显著降低，仙茅苷的清除率（CL）显著升高，表明仙茅与淫羊藿的配伍减少了成分的吸收。（2）Morris水迷宫实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠在第3天及之后花费更长的时间找到平台，模型组大鼠穿越平台次数以及在平台所在象限停留的时间显著升高;ELISA实验结果显示，与正常组相比，模型组海马区TNF-α和IL-1β的含量升高;透射电镜实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠海马CA3区小胶质细胞的内质网发生水肿、线粒体消失、脂褐素可见;这些结果均表明Aβ1-42诱导的大鼠表现出轻度AD症状。（3）CREF组和Aβ+CREF组的药动学实验结果表明，与CREF组相比，Aβ+CREF组中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、朝藿定B和淫羊藿苷的AUC0-∞和Cmax均升高，CL均降低。与之相反，与CREF组相比，Aβ+CREF组中宝藿苷Ⅰ的Cmax降低。 结论: 1.CREF的原型入血成分包括12种化合物，其中大部分为仙茅的酚苷类成分和淫羊藿的黄酮类成分。 2.CREF可能通过调控MAPK、PI3K/Akt等信号通路，靶向TNF、Akt、MAPK3等靶点，抑制炎症反应、调节细胞凋亡、改善突触可塑性，从而发挥改善轻度AD的作用。 3.仙茅与淫羊藿的协同作用不体现在药动学的改变，但Aβ1-42导致的病理状态会影响CREF中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、朝藿定B、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ的药动学特征，为CREF的配伍机制和临床前研究提供了依据。
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