摘要
目的： 近年来，全球人口老龄化已经是全世界最重要的医疗和社会人口问题。在针灸“治未病”理论指导下，本研究以“未病先防”、“既病防变”为重点，从中缝背核5-HT能神经元-海马CA1区谷氨酸能神经元环路影响突触可塑性的角度切入，研究预电针可能通过调控中缝背核(Dorsal raphe nucleus,DRN)5-HT能神经元兴奋性以影响海马CA1区谷氨酸能神经元兴奋性，进而改善APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer''s disease,AD)模型小鼠突触可塑性损伤和学习记忆障碍的作用及机制。本文不仅有助于阐明预电针防治AD学习记忆障碍的神经生物学机制，也有望促进预电针防治AD学习记忆障碍的临床应用和推广。 方法： 12只4月龄雄性野生型C57BL/6小鼠作为正常对照组，24只雄性APP/PS1双转基因小鼠，随机分为预电针组、模型组，每组各12只。预电针组予以针刺百会、肾俞穴干预。一对导线分别接百会和肾俞穴，左右侧肾俞交替使用。电针频率2Hz，电流1mA，以穴位局部颤动为佳，留针20min,隔日1次，每周3次，共治疗8周。正常组、模型组在预电针组干预时进行相同的抓取捆绑固定。各组小鼠干预结束后予以新物体识别实验和Morris水迷宫实验。行为学实验结束后进行新鲜海马、中缝背核组织取材和灌注取材并进行指标检测。应用免疫荧光检测中缝背核c-Fos的表达，应用高尔基染色法观察海马CA1区树突棘密度;应用Western-Blot法检测海马区5-HT1B受体蛋白表达水平。 72只4月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠，随机分为6组，分别是模型组、预电针组、对照病毒组、预电针+对照病毒组、中缝背核Gq兴奋组、预电针+中缝背核Gi抑制组，每组12只。其中中缝背核Gq兴奋组、预电针+中缝背核Gi抑制组、对照病毒组、预电针+对照病毒组采用化学遗传策略，将化学遗传兴奋性病毒、化学遗传抑制性病毒和空载对照病毒用脑立体定位注射到APP/PS1小鼠DRN脑区，激活或抑制5-HT能神经元。注射病毒14天后，对照病毒组、预电针+对照病毒组腹腔注射生理盐水，兴奋组和预电针+抑制组腹腔注射氯氮平一氧化氮（clozapine N-oxide，CNO）,30min后，用相同规格的鼠衣进行抓取和捆绑，对照病毒组和中缝背核Gq兴奋组不做其他处理，预电针+对照病毒组和预电针+抑制组进行预电针干预，方法同上。模型组及预电针组干预同上。隔日一次，每周3次，每次20min,共8周。各组小鼠干预结束后予以新物体识别实验和Morris水迷宫实验。应用免疫荧光检测中缝背核TPH2/c-Fos荧光双标，海马CA1区VGLUT1荧光单标、Neurogranin/c-Fos荧光双标的表达及定位;应用高尔基染色法观察海马CA1区树突棘密度;应用Western-Blot法检测海马区 5-HT1B 受体、PSD、SYP、BDNF、GluA1、GluA2/3 的蛋白相对表达量。 结果： 1.预电针可以提高APP/PS1小鼠的学习记忆能力。 （1）新物体识别实验结果:与正常组相比，模型组的小鼠的新物体优先指数明显下降（P＜0.01）。而与模型组相比，预电针组小鼠的新物体优先指数明显升高（P＜0.01）。 （2）Morris水迷宫实验结果:与正常组相比，模型组的小鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），预电针组小鼠的逃避潜伏期时间较模型组显著减少（P＜0.01）。空间探索实验中，模型组在目标象限探索的时间较正常组显著下降（P＜0.01）。预电针组的空间探索时间较模型组明显延长（P＜0.01），且游泳轨迹较模型组而言，更密集出现在目标平台周围。 2.预电针可以提高APP/PS1小鼠海马CA1区突触结构可塑性。 （1）海马CA1区树突棘密度:与正常组相比，模型组树突棘密度显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，预电针组树突棘密度明显升高（P＜0.01）。 3.预电针可以提高APP/PS1小鼠中缝背核神经元兴奋性以及海马5-HT1B受体的表达。 (1)中缝背核神经元兴奋性结果:与正常组相比，模型组小鼠中缝背核c-Fos阳性神经元率显著降低(P＜0.01)。与模型组相比，预电针组小鼠c-Fos阳性神经元率升高(P＜0.05)。 (2)海马区5-HT1B的蛋白水平:与正常组相比，模型组海马区5-HT1B的蛋白水平显著下降(P＜0.01),与模型组相比，预电针组海马区5-HT1B的蛋白水平上升(P＜0.05)。 4.预电针可以提高APP/PS1小鼠中缝背核5-HT能神经元兴奋性以及海马5-HT1B受体的表达水平。 (1)中缝背核5-HT能神经元兴奋性结果:与模型组相比，对照病毒组中缝背核区TPH2/c-Fos阳性神经元率无明显统计学差异(P＞0.05);与预电针组相比，预电针+对照病毒组中缝背核区TPH2/c-Fos阳性神经元率无明显统计学差异(P＞0.05)。与模型组相比，预电针组和中缝背核Gq兴奋组中缝背核区TPH2/c-Fos阳性神经元率均显著升高(P＜0.01)。与预电针组相比，预电针+中缝背核Gi抑制组小鼠中缝背核区TPH2/c-Fos阳性神经元率明显降低(P＜0.01)。 (2)海马区5-HT1B的蛋白水平:与模型组相比，对照病毒组海马区5-HT1B的蛋白水平无明显统计学差异(P＞0.05);与预电针组相比，预电针+对照病毒组海马区5-HT1B的蛋白水平无明显统计学差异(P＞0.05)。与模型组相比，预电针组和中缝背核Gq兴奋组小鼠海马区5-HT1B的蛋白水平均明显升高(P＜0.01)。与预电针组相比，预电针+中缝背核Gi抑制组小鼠海马区5-HT1B的蛋白水平明显降低(P＜0.01)。 5.预电针可以通过提高中缝背核5-HT能神经元兴奋性提高APP/PS1小鼠学习记忆能力。 (1)新物体识别实验结果:与模型组相比，对照病毒组的小鼠的新物体优先指数无明显统计学差异(P＞0.05);与预电针组相比，预电针+对照病毒组小鼠的新物体优先指数无明显统计学差异(P＞0.05)。与模型组相比，预电针组小鼠的新物体优先指数明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，中缝背核Gq兴奋组小鼠的新物体优先指数明显升高(P＜0.01）。与预电针组相比，预电针+中缝背核Gi抑制组小鼠的新物体优先指数明显降低（P＜0.01）。 （2）Morris水迷宫实验结果:定位航行实验中，与模型组相比，对照病毒组小鼠的逃避潜伏期无明显统计学差异（P＞0.05）;与预电针组相比，预电针+对照病毒组小鼠的逃避潜伏期无明显统计学差异（P＞0.05）。与模型组相比，预电针组和中缝背核Gq兴奋组小鼠的逃避潜伏期显著缩短(P＜0.01）。与预电针组相比，预电针+中缝背核Gi抑制组小鼠的逃避潜伏期显著延长（P＜0.01）。空间探索实验中，与模型组相比，对照病毒组小鼠的目标象限停留时间无明显统计学差异（P＞0.05）;与预电针组相比，预电针+对照病毒组小鼠的目标象限停留时间无明显统计学差异（P＞0.05）。与模型组相比，预电针组和中缝背核Gq兴奋组小鼠的目标象限停留时间均延长（P＜0.01），且游泳轨迹多集中在目标平台附近。与预电针组相比，预电针+中缝背核Gi抑制组小鼠的目标象限停留时间明显缩短（P＜0.01）。 结论： 1.预电针能够改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力。通过提高突触功能可塑性和结构可塑性，改善突触损伤，可能是预电针防治APP/PS1小鼠学习记忆能力障碍的重要机制之一。 2.预电针可以通过激活中缝背核5-HT能神经元—海马CA1区谷氨酸能神经元环路，上调海马区5-HT1B受体和海马CA1区谷氨酸AMPA受体(GluA1、GluA2/3亚基为主)的表达，增强突触可塑性，参与防治APP/PS1小鼠学习记忆能力损伤。
NETL