摘要
目的: 胰腺癌是临床常见的恶性程度极高的消化系统肿瘤之一，具有发病隐匿，预后极差的特点，其逐年升高的发病率及死亡率所带来的负担也在急剧增加。早期诊断胰腺癌难度大，临床发现时已多为晚期不具备手术机会，并且极易出现远处转移。目前胰腺癌的临床疗效有限，放化疗、靶向、免疫治疗等并未取得较大进展，因此亟需寻找新的有效治疗方法及药物。瓦博格效应是指肿瘤细胞即使在氧气充分的条件下，依然优先选择低产能的有氧糖酵解进行糖代谢的现象。瓦博格效应可通过有氧糖酵解消耗葡萄糖从而快速获取能量以满足肿瘤生长的需要，其活跃程度与丙酮酸激酶2（PMK2）、乳酸脱氢酶A（LDHA）等糖酵解相关酶的表达密切相关，而最终产生的乳酸堆积能明显促进肿瘤细胞的增殖和转移胰腺癌内部丰富的间质组织造就了缺氧、低血供的肿瘤微环境，Warburg效应有利于胰腺癌细胞对抗这种复杂环境，因此抑制胰腺癌细胞糖酵解可有效控制肿瘤生长。中医药具有多靶点、多效应、多途径的优势，临床研究证实乌梅丸能有效干预胰腺癌进程，改善胰腺癌患者临床症状，延长患者生存期。近年来针对乌梅丸抗肿瘤作用的临床及基础研究越来越多，基础研究结果表明乌梅丸能够抑制胰腺癌细胞异常增殖，促进肿瘤细胞凋亡，拮抗全身炎症反应和抑制血管生成等作用，但以上研究机制并没有很好地用现代医学理论阐述清楚。研究组通过观察总结临床胰腺癌患者的症状特点，发现《伤寒论》六经病中厥阴病的主证与胰腺癌的临床症状有着高度相似性，并且厥阴病寒热错杂证的内涵与代谢重编程存在紧密的关联，因此研究组以肿瘤糖酵解关键酶在胰腺癌中的影响为切入点，尝试探讨临床应用乌梅丸通过干预肿瘤糖酵解治疗胰腺癌的可能机制，为临床治疗胰腺癌提供新方法和新思路。 本研究从临床标本着手，通过观察糖酵解相关酶PMK2、LDHA在胰腺癌组织及癌旁组织中表达的差异，分析其与胰腺癌临床病理特征的关系，同时利用GEPIA数据库对比PMK2 mRNA、LDHA mRNA分别在胰腺癌及正常组织中的差异表达，并分析其与胰腺癌预后的相关性。在此基础上，探讨乌梅丸含药血清对人胰腺癌SW1990细胞的抗肿瘤作用及对其糖酵解的影响，并初步探讨其作用机制，为临床应用中医药治疗胰腺癌提供新思路和药物选择。 方法: 1.理论探讨:系统回顾并总结了中医经典古籍对于胰腺癌病名、病因、病机、治法等方面的研究，并基于胰腺癌寒热错杂的主证及中医“厥阴病”寒热错杂证的内涵，对乌梅丸治疗胰腺癌进行理论分析和探讨。 2.临床研究:利用组织芯片及免疫组化技术，从48例胰腺癌组织及配对癌旁组织中，最终选取42例符合观察的84个位点胰腺癌相关数据进行免疫组织化学染色，检测42例胰腺癌组织及相应癌旁组织中PMK2、LDHA蛋白的表达，并分析二者与胰腺癌患者临床病理特征的相关性;利用GEPIA数据库对比胰腺癌组织及相应癌旁组织中PMK2、LDHA基因的表达，对胰腺癌患者PKM2、LDHA基因的表达进行生存分析，评估PKM2、LDHA对胰腺癌患者预后的影响。 3.实验研究: 实验一:按随机数字法将16只健康SPF级SD大鼠分为两组，含药血清组和空白血清组各8只，含药血清组按3g/kg剂量的乌梅丸给药，药物以生理盐水稀释后按10ml/kg每日给大鼠灌胃，空白血清组每日给大鼠灌胃等体积生理盐水，每日间隔8h分两次给药，连续灌胃给药3天。于第4天强制禁食不禁水15h，两组大鼠灌胃全天剂量1h后，以10％水合氯醛按3.3ml/kg剂量腹腔注射麻醉，于腹主动脉采血，静置于室温下2h,上离心机按4000 r/min转速离心10 min,分离并收集各组血清，即取得含药血清与空白组血清。同组血清分别合并混匀后，于56℃水浴条件下灭活30分钟。在超净台无菌条件下，以0.22um无菌微孔滤膜过滤，保存于-20℃冰箱中备用。体外培养人胰腺癌SW1990细胞，实验分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组共4组:低剂量组以2％乌梅丸含药血清+8％空白血清+RPMI-1640培养基配制、中剂量组以4％乌梅丸含药血清+6％空白血清+RPMI-1640培养基配制、高剂量组以8％乌梅丸含药血清+2％空白血清+RPMI-1640培养基配制、对照组以10％空白血清+RPMI-1640培养基配制。利用细胞增殖与活性检测（CCK-8）法测定各组乌梅丸含药血清对人胰腺癌SW1990细胞增殖的影响，并确定乌梅丸含药血清最佳作用时间;利用平板克隆试验、细胞划痕试验、Transwell侵袭试验分别检测各组乌梅丸含药血清对人胰腺癌SW1990细胞克隆形成能力、迁移能力及侵袭能力的影响;利用Annexin Ⅴ-APC/7-AAD流式细胞术检测乌梅丸含药血清对人胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响。 实验二:体外培养人胰腺癌SW1990细胞，按实验一分组用各组乌梅丸含药血清干预后，利用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测乌梅丸含药血清对PKM2、LDHA蛋白表达的影响;利用葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒及ATP试剂盒，检测乌梅丸含药血清对人胰腺癌SW1990细胞葡萄糖消耗、乳酸累积及ATP含量的影响;利用Western blot法检测PI3K/Akt/mTOR 通路中 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt,mTOR、p-mTOR 以及缺氧诱导因子1-α（HIF-1 α）蛋白表达水平。 结果: 1.通过理论探讨认为乌梅丸治疗胰腺癌具有一定的理论依据和深刻的现实意义，胰腺癌的病名应归于中医“积证”范畴，病机可从厥阴病所致寒热错杂来认识，脾胃功能受损所致脾胃升降失司可能是形成肿瘤患者寒热错杂症状的根本原因。如果脾胃功能持续受损，日久则“脾气散精”的生理趋势遭到破坏，精微物质受困于中焦，浊气流向下焦，继而阴火内生，能量暗耗，物质与能量的流量及流向转变，即可出现临床寒热错杂证，结合当下肿瘤代谢的热点，该过程与代谢重编程存在紧密的关联，因此推测乌梅丸治疗胰腺癌可能是通过调节胰腺癌代谢重编程中糖代谢发挥抗肿瘤作用的。 2.临床研究发现42例胰腺癌组织中PKM2高表达为83.33％（35/42）,在其对应的癌旁组织中，高表达为26.19％（11/42）,两者比较差异有统计学意义（X2=27.68，P＜0.001）;42例胰腺癌组织标本中LDHA的高表达为73.81％（31/42）,在其对应的癌旁组织中，高表达为11.90％（5/42）,两者比较差异有统计学意义（X2=32.86,P＜0.001）;PKM2在不同性别、年龄、分期、分化程度、发生部位及是否合并淋巴结转移的胰腺癌组织中的表达差别均无统计学意义（P＞0.05）;LDHA在不同性别、年龄、分期、分化程度、发生部位及是否合并淋巴结转移的胰腺癌组织中的表达差别均无统计学意义（P＞0.05）;运用GEPIA数据库对其收录的179例胰腺导管腺癌（PAAD）癌组织和171例正常胰腺组织中PKM2的基因进行比较，结果提示PKM2基因在胰腺癌组织中表达明显上调（P＜0.05）;GEPIA数据库中179例胰腺导管腺癌（PAAD）癌组织和171例正常胰腺组织中LDHA基因进行比较，结果提示LDAH基因在胰腺癌组织中表达明显上调（P＜0.05）;89例PKM2基因高表达的患者总生存期（OS）均较89例PKM2低表达者更短（P＜0.05）、无疾病进展生存期（DFS）较低表达者也更短（P＜0.05）;89例LDHA基因高表达的患者总生存期（OS）均较89例LDHA低表达者明显更短（P＜0.0001）、无疾病进展生存期（DFS）较低表达者也明显更短（P＜0.0001）。这说明胰腺癌组织中糖酵解相关酶PKM2、LDHA表达明显升高并提示不良预后，将糖酵解相关酶PKM2、LDHA作为干预糖酵解的治疗靶点可作为治疗胰腺癌的切入点，为下一步实验提供了思路。 结论: 1.基于中医药理论对乌梅丸治疗胰腺癌进行探讨，胰腺癌的中医病因病机复杂，目前并未达成统一的认识。从厥阴病寒热错杂证的角度出发研究其病因病机与治疗具有一定理论依据，认为乌梅丸“从厥阴论治”胰腺癌可能是通过干预胰腺癌糖代谢达到抑制胰腺癌生长作用的，可为进一步探索中医药治疗胰腺癌提供理论依据。 2.PKM2、LDHA蛋白在胰腺癌组织中的表达均明显高于其癌旁组织，两者均与不同性别、年龄、分期、分化程度、发生部位及是否合并淋巴结转移均无明显相关性。PKM2 mRNA、LDHA mRNA在胰腺癌组织中的表达均明显高于正常胰腺组织，其高表达与胰腺癌的不良预后相关。 3.乌梅丸含药血清能降低糖酵解相关酶PKM2、LDHA的表达，继而调控胰腺癌有氧糖酵解的水平，从而抑制SW1990胰腺癌细胞的恶性生物学行为，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，下调PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，抑制核转录因子HIF-1α激活，进而下调糖酵解相关酶LDHA以及PKM2的表达，调控肿瘤糖酵解，实现抑制肿瘤细胞恶性生物学行为作用的。
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