摘要
小麦(Triticum aestivum L.，2n=6x=42,AABBDD)是世界上主要粮食作物之一。近年来，随着遗传学与基因组学不断发展，人们对小麦开花调控途径的认识逐渐完善。在小麦生长发育进程中，光周期、春化等各种途径相互作用，构成小麦开花调控网络。春化基因在小麦开花调控网络中占有重要地位，是连接光周期、春化、年龄等途径的枢纽，在植物开花调控中发挥重要作用。对春化基因的研究自上世纪90年代就已开展，尽管已定位克隆了四个春化基因，但对于小麦春化基因在调控植株发育中的功能，及其在观赏型小麦新品种培育中的应用有待进一步的研究与探讨。本研究利用EMS诱变剂对济麦38、济麦44、鲁研128、山农30四个冬小麦品种进行化学诱变处理，筛选M2代开花障碍突变体材料；通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对春化关键基因 VRN1和VRN3进行敲除，解析不同敲除类型与表型之间的关系，进一步证明VRN1与VRN3两个基因在开花调控中的关键作用。目前研究结果如下： 1.获得小麦开花障碍突变体株系407份。在抽穗开花期，对上述四个品种的EMS突变体M2代进行大田表型鉴定，筛选只进行营养生长而未拔节开花或晚抽穗开花的突变体材料，共计407份，命名为开花障碍突变体。从中选取95株可以稳定遗传的突变体材料进行HI-TOM二代测序，发现共22株材料在VRN1或VRN3两个基因不同位点发生了突变，推测开花障碍表型可能是由于两个春化基因突变造成的。 2.VRN3基因功能缺失影响小麦从营养生长向生殖生长转变过程及株高、穗型、花粉育性等农艺性状。为进一步探索春化基因对小麦从营养生长到生殖生长转变的影响，本研究针对VRN1、VRN3两基因构建了CRISPR-Cas9敲除载体。以春小麦Fielder及冬小麦济麦38、山农30为受体进行遗传转化，共得到790株转基因再生苗，经鉴定有112株为阳性植株。其中，VRN3单基因双靶点敲除载体阳性苗59株，VRN1+VRN3双基因同时敲除载体阳性苗53株。选取其中104株阳性苗进行HI-TOM测序，结果显示90%以上材料发生了目标基因定点编辑。在成功编辑的材料中，VRN1基因位点编辑率达11%，VRN3基因位点编辑率达89%。通过对基因编辑材料的表型、抽穗时间及花粉育性等调查统计发现，VRN3基因的功能缺失会导致开花延迟、株高降低及花粉不育等表型。 3.构建外源春化基因PAM位点改造载体及特色小麦SPT技术。为对开花障碍表型进行应用，本研究将外源表达量较高的春化基因VRN1、VRN3的PAM位点进行改造，使作为外源导入的 VRN1、VRN3基因不被敲除载体中的Cas9蛋白识别。敲除载体与PAM位点改造载体同时进行遗传转化时，外源春化基因可以在植物体内正常发挥作用。将上述PAM位点改造的春化基因与蓝粒基因紧密连锁，构建新型制种体系。目前该部分遗传转化获得85株再生苗。后续将利用颜色标记对其进行筛选，统计阳性植株的种子颜色分离比。 综上所述，本研究通过EMS诱变及基因编辑技术对春化基因VRN1、VRN3进行功能验证，确定上述两个基因功能缺失后会引起植株表型发生改变，影响小麦从营养生长向生殖生长的转变过程。通过对外源回补春化基因的PAM位点改造，使得在敲除载体存在时外源基因仍可正常发挥作用，并将其与蓝粒基因紧密连锁构建新型制种体系。此外，本研究对EMS诱变得到的斑叶小麦进行再利用，为未来创造可绿化园林的新型观赏小麦奠定基础。
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