摘要
在小麦生产中，赤霉病和条锈病等病害对其生产安全性影响极大，前者是由死体营养型真菌禾谷镰刀菌引起的小麦穗部病害，后者是由活体营养型真菌小麦条锈菌引起的叶部流行性病害。合理利用已有的、并积极研发新型的抗病品种是目前防治小麦赤霉病和条锈病最为经济高效、绿色环保的方式，针对性精确修饰基因组的基因组编辑方法为遗传改良植物抗病性提供新方法。挖掘抗性基因和易感基因资源，对于精准育种至关重要，易感基因在抗性抑制的发病机制中占有重要地位，基因组编辑技术有效编辑易感基因在抗病育种中具有广阔前景。本研究初步探究了一个免疫负调控基因ROD1（Resistance of Rice to Diseases 1）,其编码一种钙信号感受蛋白，小麦中ROD1的表达受禾谷镰刀菌和条锈菌侵染的诱导调控，探究该易感基因的有效编辑在创制赤霉病和条锈病抗性小麦材料方面的应用可能具有重要意义。具体结果如下: 1.本研究利用植物基因组数据库Ensembl Plants,以水稻OsROD1编码的蛋白序列为模板，从目前小麦全基因组中筛选得到免疫负调控基因TaROD1,发现在小麦中存在3个同源基因，分别为TaROD1-7D、TaROD1-7A、TaROD1-4A。根据RNA-seq公共数据库分析接种禾谷镰刀菌、条锈菌后3个同源基因的转录水平高低，筛选出受禾谷镰刀菌诱导最为显著的基因TaROD1-7A,该基因的CDS序列全长为657 bp,编码218个氨基酸。 2.生物信息学分析发现TaROD1编码蛋白的分子量为2.22 kDa。TaROD1蛋白属于亲水性蛋白，且不具有信号肽和跨膜结构域、N-端不存在明显的信号肽特征。同源进化分析发现TaROD1-7D和D亚基因组供体节节麦AetROD1同源性最高，TaROD1-7A和A亚基因组供体乌拉尔图小麦TuROD1同源性最高，但是TaROD1-4A与AetROD1同源性却高于TuROD1，且在染色体上分布位置异于TaROD1-7D和TaROD1-7A，TaROD1在小麦A、B、D亚基因组分布上呈现不对称性，推测这三个同源基因的来源不同，TaROD1-4A的形成可能与染色体易位有关。多物种基因进化树分析发现ROD1蛋白在谷物中的序列高度相似，C2结构域在麦类进化中高度保守。 3.通过qRT-PCR对TaROD1进行表达模式分析。时空表达模式分析发现TaROD1在不同生育时期及组织部位均有表达，但在不同生长发育阶段的叶中表达量相对高于根、茎等组织部位;在感病品种春小麦Fielder中TaROD1的3个同源基因都受禾谷镰刀菌及小麦条锈病病原菌的诱导上调表达，但上调表达模式不尽相同，响应侵染存在时间上的差异。 4.利用同源重组方法构建TaROD1-7A过表达载体，边切边连方法构建TaROD1的CRISPR/Cas9载体，获得过表达和rod1突变体。运用CRISPR/Cas9技术对TaROD1进行基因编辑，获得有效编辑植株4种类型的单突变体rod1-d1和1种双突变体rod1-a1d1;TaROD1的过表达株系与rod1突变体的抗氧化相关酶活差异显著，抗氧化相关酶酶活性:过表达株系＞野生型WT＞rod1突变体。 5.抗病性验证及产量相关性状调查。以两叶一心期的野生型、rod1突变体和过表达株系叶片为试验材料，对其接种条锈菌，rod1突变体表现出明显的条锈病抗性。同时，对开花期的rod1突变体、过表达和野生型材料接种禾谷镰刀菌，rod1突变体展现出较强的赤霉病抗性。对产量相关性状单株分蘖数、穗粒数和千粒重进行统计学分析,发现该基因的有效编辑在调控抗病性的同时对产量无显著影响。 本研究通过将候选基因TaROD1转化小麦植株，获得过量表达与CRISPR突变体植株，分析正常生长状态以及病原侵染条件下的转基因植株相较于野生型WT内的显著的抗氧化酶活性，小麦体内TaROD1受禾谷镰刀菌和条锈菌侵染的响应模式，为敲除易感基因在创制小麦赤霉病和条锈病抗性材料提供了参考。
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