摘要
绵羊是我国重要的经济动物，其繁殖性能是衡量其经济性状的重要指标。繁殖是一个复杂而重要的生理过程，依赖于下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)激素的协调、合成和释放。下丘脑在绵羊生殖过程中起着至关重要的作用，作为HPGA轴的起始器官，可以产生促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)信号，调节下游激素的分泌，包括促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)，进而影响生殖活动，如卵泡发育、排卵和产卵等。目前对绵羊繁殖性能的研究主要集中于卵巢组织，对下丘脑影响绵羊繁殖性能机制的相关研究报道较少。 本研究选用1岁龄的小尾寒羊(高繁殖力XH组)和洼地绵羊(低繁殖力XL组)的下丘脑组织作为研究对象。提取总RNA,构建cDNA文库(Complementary deoxyribonucleic acid)，进行 ONT(Oxford nanopore technologies)全长转录组测序数据分析，筛选出差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)进行GO注释和KEGG通路富集分析，找出与生殖过程及机体发育相关的基因，构建调控网络并筛选核心基因，进而对绵羊的生殖过程与机体发育过程有更加深入的了解。随机选择差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证全长转录组测序结果的准确性，并使用RT-qPCR技术检测核心基因在小尾寒羊其他组织中的表达情况。采用竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)技术对 211 只小尾寒羊母羊 IRS1 基因g.229074861C＞T位点进行基因分型并与其繁殖性状和生殖激素指标分别进行关联分析。主要结果如下: (1)全长转录组文库构建结果显示，6个绵羊下丘脑组织文库共获得43.4 Gb Clean data,两组分别获得27,911,258和13,844,371条Clean reads,分别占原始序列读数的95.1％和95.99％。质控后分别得到全长序列21,566,991和10,627,881条，全长序列与绵羊参考基因组的比对率均在80％以上，各文库构建质量较好。 (2)高低繁组差异表达基因分析结果表明，在两组间共鉴定出25,246个基因，新基因7,482个。按照P adjust＜0.05且|log2FC|＞1为标准筛选出2,114个DEGs,在高繁组中有1，247个基因上调，867个基因下调。 (3)差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果表明，GO注释结果集中富集在细胞器官、生物调控、结合和催化活性等条目，KEGG富集分析结果显示差异表达基因参与卵母细胞减数分裂、孕酮介导的卵母细胞成熟、卵巢类固醇生成、GnRH分泌和催乳素信号通路等与生殖相关的调控途径。 (4)生殖过程与机体发育调控网络结果显示，核心基因为GSK3B、PPP2R1B、PPP2CB、YWHAQ、YWHAZ、YWHAH、MAP2K1、FOXO1 和 IRS1。 (5)差异表达基因的RT-qPCR验证结果表明，定量结果和转录组测序结果一致，说明全长转录组测序生成的数据是可靠的。小尾寒羊中核心基因的组织表达谱结果表明，GSK3B基因和PPP2CB基因在小尾寒羊各组织中均有表达，在乳腺中的表达量最高，在卵巢中的表达量最低。 (6)使用KASP基因分型技术发现核心基因IRS1基因g.229074861C＞T位点与小尾寒羊群体产羔数显著相关，CC型产羔数最高。 综上所述，本试验利用ONT全长转录组测序技术对高繁小尾寒羊和低繁洼地绵羊的下丘脑组织进行转录组测序，在两组间筛选出GSK3B、PPP2R1B、PPP2CB、YWHAQ、YWHAZ、YWHAH、MAP2K1、FOXO1和IRS1等关键候选基因，这些基因可能在生殖激素分泌、卵泡发育及胚胎发育等生殖生理过程中发挥重要作用，发现IRS1基因g.229074861C＞T位点与小尾寒羊群体产羔数显著相关，该位点可作为小尾寒羊产羔数性状选择的潜在分子标记。本研究为进一步探讨绵羊高繁性能机制和培育高繁殖力绵羊新品种提供了参考数据。
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