摘要
鸡星状病毒（Chicken Astrovirus，CAstV）属于禽星状病毒属，是在生长缓慢的商品肉鸡中发现的一种新型肠道病毒，肉鸡在1日龄至4周龄期间最易感染，这也是肉鸡肠炎主要暴发期。该病毒既可通过粪-口途径水平传播，也可以通过母鸡垂直传播，导致雏鸡出现肠炎、肾炎和生长迟缓等疾病。中国CAstV感染普遍，且呈上升态势，几乎所有省份都检测到了 CAstV感染，对我国家禽养殖业危害巨大。疫苗接种是一种关键的预防性措施，用于防止病毒性疾病的传播。目前，还没有商业化疫苗或其它方法预防星状病毒病。本项研究采用了复制缺陷型的人5型腺病毒（rAd5）作为载体，目的是构建一种针对CAstV的重组腺病毒载体活疫苗，该疫苗对于CAstV预防，推动我国禽业的健康发展具有重要意义。 本研究中CAstV开放阅读框ORF2负责编码病毒的衣壳结构蛋白，其在星状病毒颗粒的组装中扮演重要角色，并且还能够和宿主细胞产生相互作用，能够激发机体产生免疫反应并促使生成保护性抗体的主要免疫原。因此，选用CAstV-ORF2蛋白作为疫苗开发的理想抗原。首先，构建PET-22b原核表达载体，表达重组ORF2蛋白，新西兰大白兔接种蛋白制备ORF2衣壳蛋白的多克隆抗体;利用无缝克隆技术将ORF2目的基因克隆到携有绿色荧光蛋白的pcADV-EF1-mNeonGreen穿梭质粒中，利用AdMax腺病毒包装系统，将腺病毒骨架质粒（AdmaxTM）和穿梭质粒pcADV-EF1-mNeonGreen-CAstV-ORF2混合后，共同转染至HEK293T细胞中，进行rAd5-CAstV-ORF2的包装。在此基础上，对重组腺病毒rAd5-CAstV-ORF2进行扩增纯化，对其进行滴度测定、目的蛋白表达检测以及遗传稳定性检测。结果显示，腺病毒骨架质粒和穿梭质粒转染293T细胞后，在荧光显微镜下观察发现细胞具有绿色荧光信号，证明重组腺病毒包装成功;其病毒滴度为6.32× 1010（PFU/mL）,并且在293T细胞中连续传代10次后仍具有良好的遗传稳定性。通过验证重组腺病毒rAd5-CAstV-ORF2的转染情况、基因组、以及在连续传代过程中的遗传稳定性，证明重组腺病毒包装成功，并且具有良好的应用前景。 为了验证制备的重组腺病毒rAd5-CAstV-ORF2活疫苗的免疫原性，分别选用低剂量（107PFU/mL）、中剂量（108 PFU/mL）和高剂量（109PFU/mL）疫苗免疫SPF鸡，进行动物免疫原性实验。采用间接ELISA方法，分析不同疫苗剂量组鸡产生的CAstV特异性抗体和细胞因子水平。结果表明，三个不同剂量疫苗组鸡接种疫苗后产生了 CAstV特异性抗体，表明rAd5-CAstV-ORF2活疫苗可以成功感染SPF鸡;并且各疫苗组鸡产生的CAstV特异性抗体逐渐增加，中高剂量组鸡在14 d抗体水平达到最高（中剂量组CAstV抗体滴度:1∶3500;高剂量组CAstV抗体滴度:1∶5000）。随后CAstV特异性抗体水平逐渐下降，中剂量组42 d鸡产生的CAstV特异性抗体滴度仍可达到1∶1500,鸡体内产生的CAstV特异性抗体持续时间可以达到7周，完全覆盖商品肉鸡生长周期。疫苗组鸡细胞因子IL-4和IFN-γ水平显著高于正常组，表明该疫苗能够激发鸡体内Th2和Th1类细胞因子的分泌，从而促进体液免疫和细胞免疫功能的增强。经过免疫原性实验证实，rAd5-CAstV-ORF2疫苗能够诱导高水平CAstV特异性抗体产生，增强体液免疫和细胞免疫反应，表现出良好的免疫原性。 为明确重组腺病毒rAd5-CAstV-ORF2活疫苗的动物保护效果，根据免疫原性实验探究，选择中剂量组（108PFU/mL）设计动物保护实验。将100只健康的1日龄的SPF雏鸡分为攻毒组、疫苗+攻毒组（40只）、疫苗组和和正常对照组。结果表明，大部分免疫鸡群羽毛柔顺，精神状态没有异常迹象，体重增长正常，仅有14d2只鸡、21 d2只鸡、28 d 1只鸡出现体重小（近似攻毒组鸡体重）、精神沉郁、羽毛杂乱和腹泻，发病率为12.5％（5/40）;从大体剖检观察以及病理组织学观察可以看出SPF鸡免疫后组织器官发育正常且无明显病变。通过体外排毒和体内组织带毒检测发现，7 d CAstV阳性检出率较高，随着抗体水平上升，21 d CAstV检出率下降，约为12.5％。通过对生长性能指标、各组鸡抗体水平、免疫器官指数动态变化、体外排毒情况、体内组织带毒情况、大体剖检等方面进行监测，发现rAd5-CAstV-ORF2对家禽具有良好的保护作用，保护率最低可以达到87.5％。未能实现100％保护可能是由于多种复杂因素共同作用。rAd5-CAstV-ORF2活疫苗缺乏稳定剂，会影响其储存、运输和使用时的稳定性;并且人为因素如注射部位准确性和注射器清洁度等也会影响疫苗效果。此外，雏鸡在3日龄肌肉注射易产生强烈应激反应，导致免疫功能紊乱，从而影响疫苗保护效果。 综上所述，本研究构建的重组腺病毒载体rAd5-CAstV-ORF2活疫苗，该疫苗显示出高效的免疫原性，能够诱导产生高水平的CAstV抗体。通过激活宿主的体液和细胞免疫反应，为宿主提供保护，避免因CAstV感染导致家禽损伤和生产性能下降，为临床防控CAstV引起的疾病提供新的技术。
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