摘要
病毒性疾病严重危害我国养猪业，其中细胞因子类生物制品在抗病毒感染中发挥重要作用，已取得良好疗效，且有着巨大市场需求。干扰素（IFN）是机体重要的具有抗病毒和免疫调节特性的细胞因子。其中，Ⅲ型干扰素（IFN-λ）是粘膜部位屏障完整性的主要保护剂，由抗原递呈细胞和上皮细胞产生，在一些上皮细胞及免疫细胞中发挥着相对独立且特异的抗病毒作用。但目前兽医临床上还没有IFN-λ相关的抗病毒生物制剂。 在前期研究中，我们成功构建了密码子优化的重组猪λ3干扰素原核表达载体，并优化了大肠杆菌表达系统实现其高效表达。本研究在此基础上，首先对重组大肠杆菌在摇瓶与发酵罐培养条件下的诱导条件进行了优化，发现将诱导剂IPTG的浓度提升至2 mM,可使猪λ3干扰素达到1g/L水平，其蛋白产量提高约8倍。通过优化菌体超声破碎工艺及包涵体洗涤与变性工艺中缓冲液使用比例，聚丙烯酰胺凝胶电泳确定菌体质量分别与超声缓冲液、洗涤缓冲液及变性缓冲液体积比为1∶10、1∶5和1∶10时最佳，降低生产成本的同时保证处理效果。之后，使用中试级蛋白纯化仪和镍柱进行亲和层析纯化，优化咪唑结合缓冲液与变性蛋白液的流速，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现40mL/min流速时蛋白结合效果最好。对纯化后的猪λ3干扰素使用透析法进行蛋白复性，同时优化蛋白复性缓冲液体系，并通过在MDBK单层细胞中加入不同剂量的重组猪λ3干扰素蛋白溶液检测干扰素活力单位，表明1％海藻糖有利于蛋白复性后的蛋白活性恢复，可使复性后的蛋白活力单位达到108U/mg。使用上述优化方法处理不同批次的发酵液均可产生约1 g/L的pIFN-λ3重组蛋白，且不同批次重组蛋白的活力单位均可达到108U/mg，表明本研究优化的包涵体处理、蛋白纯化与复性工艺稳定。为实现猪λ3干扰素在兽医临床中的使用，优化复性蛋白冻干工艺中的甘露醇、K30和海藻糖添加方案，通过冻干后的形态、复溶难易程度及干扰素活力单位检测等指标，确定应用高浓度甘露醇、高浓度K30和低浓度海藻糖作为冻干保护剂制成冻干蛋白的剂形态较好、性状稳定、易溶解，且溶解后活性无明显损失。进一步通过荧光定量PCR检测发现，猪IFN-λ3蛋白能够在猪肾细胞PK-15中诱导干扰素刺激相关基因MX1、OAS1b和ISG15的表达水平显著上调，表明该重组猪”干扰素具有较好的生物学活性。 综上所述，本研究优化了重组猪λ3干扰素发酵罐培养与包涵体提取和处理的条件，确定了中试蛋白纯化的最佳方案，摸索出透析法复性蛋白时保留干扰素活性的工艺，验证该工艺的稳定性，并通过优化蛋白冻干工艺，获得具有较高产量和良好抗病毒活性的重组猪λ3干扰素冻干注射剂。最终，建立了原核表达重组猪λ3干扰素的中试产品制备工艺流程，降低了生产成本，为其工业化生产奠定坚实基础，也为猪养殖业健康发展提供候选生物制品提供技术支持。
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