摘要
目的： 新型冠状病毒感染(COVID-19)大流行期间出现多起家养或野生动物感染事件。传播流行于动物的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(SARS-CoV-2)或其他类SARS 冠状病毒(SARS-like-CoV)存在着相对独立的变异与进化机会，并可由此导致新的大疫风险。随着疫情在时间和空间上的推移，受感染的宿主种类和种群都得到了前所未有的扩大，跨物种传播并引起下一次大流行爆发的风险持续增加。分析宿主动物对SARS-CoV-2的易感性，寻找病毒潜在的哺乳动物宿主并确定重点监测的前哨宿主物种对于切断传播链、有效阻止疫情的暴发或再发以及防止下一次大流行的发生具有重大意义。 方法： 本研究首先基于SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)基因组学数据初步分析非人哺乳动物宿主对SARS-CoV-2的易感性。从GISAID EpiCoV和NCBI数据库中收集人源和非人哺乳动物来源的SARS-CoV-2病毒基因组数据，根据其宿主动物的种、属、科、目等分类层次进行合并;在宿主动物的各分类层次上对SARS-CoV-2与宿主嗜性密切相关、在病毒跨物种传播的过程中起着重要作用的病毒S蛋白使用MEGA进行系统发育分析;使用Lasergene软件分析各层次宿主动物来源的病毒S蛋白氨基酸位点的多态性，并使用Datamonkey在线分析其选择压力位点。 针对可能的自然宿主翼手目动物，根据我国现有分布的翼手目种类，检索公共数据库来尽可能的获得这些翼手目动物的蛋白质编码序列(CDS)，使用CodonW进行碱基组成和密码子使用偏性分析，计算核苷酸组成情况以及密码子使用参数如有效密码子数(ENC)、密码子适应指数(CAI)和相对同义密码子使用度(RSCU)等。从数据库中下载的SARS-CoV-2病毒基因组CDS序列同样进行上述分析。使用SPSS20.0软件将翼手目动物与SARS-CoV-2病毒的RSCU值进行相关性分析来确定密码子使用模式与SARS-CoV-2病毒相关性较高的翼手目动物物种。最后使用平方欧几里得距离来衡量翼手目动物与SARS-CoV-2病毒的RSCU偏倚距离。 对于公共数据库中可获取转运RNA(Transfer RNA,tRNA)拷贝数据的宿主动物进行tRNA丰度及适应性分析。首先从GtRNAdb数据库中按照物种分类下载哺乳动物tRNA基因拷贝数。使用EMBOSS explorer在线分析网站的密码子使用和同义模式(CUSP)程序计算SARS-CoV-2病毒参考序列的密码子使用频率。使用SPSS20.0软件进行SARS-CoV-2病毒氨基酸密码子使用频率和哺乳动物宿主氨基酸tRNA基因频率的相关性分析。最后使用stAIcalc计算器来计算SARS-CoV-2病毒对宿主动物的tRNA适应指数，进一步分析宿主动物对SARS-CoV-2病毒的易感性。 结果： 本研究共收集6目、14科、20属、31种的非人哺乳动物来源序列数据。系统发育分析发现在COVID-19疫情流行的早期各物种携带的病毒在物种内部成簇，后期则出现较多物种间的交叉与融合。家犬(Canis lupus familiaris)、家猫（Felis catus)、美洲水鼬(Neovison vison)、白尾鹿(Odocoileus virginianus)等4个物种来源的SARS-CoV-2病毒进化树聚类与人源较近，在S蛋白全序列各位点的majority氨基酸与人源序列无差异，但存在最多的正向选择压力位点，分别多达42、28、21、18个，表现出来源于人类并积极进化和变异的倾向;较之人源SARS-CoV-2,狮子(Panthera leo)来源的病毒存在最多的显著性差异位点(9个)，正向选择压力位点也达到8个，且系统发育分析流行前后均能单独聚类，在来源上表现为不确定性但存在极大的变异风险;菊头蝠属(Rhinolophus)和穿山甲属(Manis)来源的病毒与人源差距较大，从来源上看，源于人类的可能性不大，相反，有可能是作为SARS-CoV-2或其他SARS-like-CoV的自然储存池。犬属(Canis)，美洲水鼬属(Neovison)和豹属(Panthera)存在最多的正向选择压力位点。本研究所涉及到的所有非人哺乳动物来源序列与人源序列对比共发现了 15个显著性差异位点，其中位于关键区域(受体结合域(RBD)和furin酶切位点)的有5个，分别为452、478、486、501以及681位点。 本研究一共获得了 119个翼手目动物的CDS序列，翼手目动物在整体碱基构成中GC含量偏低，基因组第三位密码子上更偏爱使用AT碱基，与SARS-CoV-2病毒的整体使用情况一致。SARS-CoV-2病毒完整CDS序列的有效密码子数为50.64,119个翼手目动物的有效密码子数变化范围较大，在35.27～60.85之间。SARS-CoV-2病毒的偏爱密码子共26个，其中25个全部以A/U结尾。RSCU聚类热图显示密码子偏好性模式与SARS-CoV-2病毒较近的翼手目物种主要来自菊头蝠属和鼠耳蝠属(Myotis)，其中聚类位置最近的是中菊头蝠(Rhinolophus affinis)。相关性分析结果显示119种翼手目动物中一共有55个翼手目物种与SARS-CoV-2病毒的RSCU值显著相关(取p值＜0.05为显著相关)，其中相关系数最大的翼手目物种是纳氏鼠耳蝠(Myotis nattereri)，其次是灰大耳蝠(Plecotus austriacus)、三叶菊头蝠(Rhinolophus trifoliatus)。金背伏翼属(Arielulus)和彩蝠属(Kerivoula)所有物种均与SARS-CoV-2病毒RSCU值显著相关且平均RSCU偏倚距离小于30。平均RSCU偏倚距离小于30的其他物种集中在鼠耳蝠属、管鼻蝠属(Murina)和菊头蝠属中。RSCU偏倚距离最小的翼手目物种是纳氏鼠耳蝠，其次是灰大耳蝠、三叶菊头蝠、彩蝠(Kerivoula picta)、黄喉黑伏翼(Arielulus torquatus)、北京鼠耳蝠(Myotis pequinius)、栉鼠耳蝠(Myotis capaccinii)。菊头蝠属中除了三叶菊头蝠之外，大菊头蝠(Rhinolophus luctus)和小褐菊头蝠（Rhinolophus stheno)的平均 RSCU 偏倚距离也小于30。 本研究一共获得47个哺乳动物物种的tRNA丰度数据，其中猕猴(Macaca mulatta)等15个哺乳动物宿主包含46种tRNA基因，缺失15种tRNA基因;其余物种均包含45种tRNA基因，缺失16种tRNA基因。SARS-CoV-2病毒氨基酸密码子使用频率与21种哺乳动物宿主氨基酸tRNA基因频率具有相关性，Pearson相关系数值最大的物种是绵羊(Ovis aries)。SARS-CoV-2病毒在不同哺乳动物宿主体内的tRNA适应指数有较大差异，在北美鼠兔(Ochotona princeps)、东非狒狒(Papio anubis)、绿猴(Chlorocebus sabaeus)、普通鼩鼱(Sorex araneus)、小耳大婴猴(Otolemur garnettii)、灰狐猴(Microcebus murinus)这6个物种中的适应指数均高于人类，其中在北美鼠兔中的适应指数最高(0.481)。除灵长目(Primates)动物，啮齿目(Rodentia)动物之外，海洋哺乳动物中的宽吻海豚(Tursiops truncatus)的适应指数也处于较高水平，tRNA池也高度适宜SARS-CoV-2病毒的复制增殖。 结论： 当前宿主动物所携带的SARS-COV-2病毒多数系由人类疫情所散播，但不能排除若干宿主动物自身携带SARS-CoV-2或类似的其他SARS-like-CoV。为了预防经过变异与进化后的SARS-CoV-2病毒变体再次传回人类而引起新的疫情，应对易感性高的家犬、家猫、美洲水鼬、白尾鹿4个种以及犬属、美洲水鼬属和豹属3个属的宿主动物需予以重点监测;为了预防其他SARS-like-CoV冠状病毒引起全新的疫情，应对狮子、穿山甲属和菊头蝠属等宿主动物予以长期监测。我们的研究发现翼手目动物在总体的碱基构成上GC含量偏低，这与SARS-CoV-2病毒的情况一致。 综合密码子偏性分析的结果来看，翼手目动物作为新型冠状病毒SARS-CoV-2自然宿主的风险高，这与当前研究结论一致。在密码子偏好性程度以及同义密码子密码子使用程度上，不同种属的翼手目动物之间差异较大，其中纳氏鼠耳蝠、灰大耳蝠、三叶菊头蝠与SARS-CoV-2病毒RSCU值相似性程度最高且偏倚距离最小，易感性程度可能较高，应该重点关注。与SARS-CoV-2病毒RSCU值相似性程度较高且偏倚距离较小的物种集中在鼠耳蝠属、管鼻蝠属、彩蝠属、菊头蝠属、金背伏翼属中，需要进行重点监测。菊头蝠属特别是三叶菊头蝠、大菊头蝠、小褐菊头蝠、中菊头蝠等作为多种冠状病毒的储存宿主应该尤为注意。 SARS-CoV-2病毒的密码子使用频率与多种哺乳动物宿主氨基酸tRNA基因频率均具有相关性，这与哺乳动物宿主普遍易感该病毒的事实相符。在北美鼠兔、东非狒狒、绿猴、普通鼩鼱、小耳大婴猴、灰狐猴这6个物种中的适应指数均高于人类，易感性可能较高，应该考虑纳入重点监测的前哨动物宿主中。除灵长目动物，啮齿目动物之外，海洋哺乳动物中的宽吻海豚也应作为潜在高风险易感宿主进行密切监测。
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