摘要
D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种天然稀有糖，其甜度是蔗糖的70％，具有高溶解度和抗氧化活性，抗炎、抗氧化、调节胆固醇水平和改善胰岛素敏感性。但D-阿洛酮糖较为稀有，无法大规模提取应用，因此低成本的D-阿洛酮糖合成策略是其工业化的关键。近年来，利用Izumoring策略以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖已经成为一种替代化学合成的更加高效的办法。但由于D-阿洛酮糖的生物转化受到D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)的转化率和酶本身产量的限制，使工业生产成本仍较为高昂。本研究首先通过对关键位点进行半理性设计和定点饱和突变，筛选获得了转化率更高，高温条件下稳定性更好的突变体。其后采用诱变育种的手段提高了工程菌株的酶表达量，最终利用多种纯化方式和气相扩散法制得了符合晶体学结构解析的初筛样本，为进一步探索转化率与空间结构变化之间的关系奠定了基础。主要结果如下: (1)DPEase半理性设计和筛选:通过对关键位点进行迭代饱和突变，构建了饱和突变库。对突变菌株摇瓶发酵后，以转化率作为关键指标采用全细胞催化的方式进行初步筛选。在构建的36种突变酶中，获得转化率明显优于原始酶的迭代突变酶213G/214D,其最适反应温度为65℃,较原始酶上升了 5℃,70℃下孵育180min后的残余酶活为原始酶的4.6倍，Mn2+、Co2+能提高突变酶213G/214D转化率，分别提高了 2.1％和2.3％，最优条件下突变酶213G/214D转化率最高可达39.1％,较原始酶转化率提升5.8％。分子动力学模拟分析发现，突变酶213G/214D在300K-500K变温下的RMSD值明显降低，由原始酶的0.43降为0.35。在333K温度下，突变酶213G/214D关键氨基酸E150和E244的羰基氧原子距离底物C3原子的平均距离分别为0.36nm和0.43nm，远小于原始酶的0.52nm和0.59nm,这可能是突变酶转化率提升的原因之一。 (2)突变酶213G/214D高效表达工程菌的选育:通过柔性肽将突变酶和绿色荧光蛋白偶联，构建了荧光强度与突变酶213G/214D表达量正相关的筛选用菌株。用紫外诱变的方式构建了突变库后，使用流式细胞仪高通量筛选出荧光强度显著升高的菌株180株。结果显示，未诱变对照96孔板的平均荧光强度为6.66*106,而经过筛选后的诱变菌平均荧光强度为1.45*107,荧光强度最高达到1.92*108。采用摇瓶发酵对荧光强度高的菌株进行复筛后，最终通过质粒消除，成功构建出了能够进行能够更高水平表达突变酶213G/214D的空白工程菌株E.coli/2E6。重新转化不含荧光蛋白的原始突变体质粒pET-20b-GD后，酶活测定显示，突变菌株酶活达到了7120U/mL,较原始菌株提高了0.78倍。 (3)突变酶213G/214D结晶条件的优化:使用高压均质和Ni柱亲和层析，大量制备初步纯化酶液后，使用超滤管进行浓缩样品和buffer置换，交替使用分子筛层析和阴离子亲和层析制得了符合晶体学样品制备所需纯度的酶液。使用气相扩散法中的坐滴法和悬滴法，经96种结晶条件筛选和优化后，制得符合晶体学结构解析的初筛样品。初筛结果显示213G/214D突变酶的结晶条件为17％(w/v)聚乙二醇，0.1 M咪唑(pH 8.0),0.25 M醋酸钙，214G/214D突变酶与底物复合体的结晶条件为14-15％(w/v)聚乙二醇、0.1M咪唑(pH 8.0)、0.2M醋酸钙，为突变酶213G/214D的晶体结构衍射分析奠定基础。
NETL