摘要
快速检测水环境中的病原菌对于食品安全和公共卫生有重要意义。基于生物培养和基于免疫学的传统检测法费时费力，需要专业的操作人员和仪器设备，无法满足现场检测（POCT）的要求。因此，迫切需要一种快速、灵敏、可定量的检测方法来检测水环境中的病原菌。侧流免疫层析法（LFIA）可以满足快速检测的需要，但检测限（LOD）通常很高，只能检测高浓度范围的目标物，仅仅能通过有无视觉信号来进行定性分析，无法对目标物进行准确的定量检测。重组酶聚合酶扩增（RPA）,是一种等温核酸扩增技术，可以在30min内将少量的核酸样本进行指数级放大。本课题开发了基于RPA的LFIA，并在此基础上进行了进一步优化，用于快速检测水环境中的病原菌，主要研究内容如下: （1）开发了一种基于链霉亲和素（SA）-生物素放大系统的侧流生物传感器，该生物传感器通过RPA和SA-生物素的两次信号放大，可用于快速定量识别沙门氏菌。样品中的微量核酸通过RPA进行指数级扩增，达到可识别的水平，构成初始信号放大。随后，扩增产物沿着侧流生物传感器流动，在流经检测线（T线）时，通过SA-生物素系统的放大能力，捕获得更多数量的金纳米颗粒（AuNPs）,从而使比色信号得到增强，形成了第二次信号放大。定量结果通过智能手机拍照并传输到计算机软件以精确计算目标数量。培养的Salmonella enteritidis用该侧流生物传感器检测，LOD为19.41 CFU/mL。在3种不同浓度下，RSD分别为3.74％、5.96％和 4.25％。 （2）为了进一步放大侧流生物传感器T线上的比色信号，开发了一种聚酰胺（PAMAM）作为高效“捕获器”的侧流生物传感器用于检测金黄色葡萄球菌。用修饰了 SA的PAMAM代替捕获抗体作为AuNPs的高效“捕获器”。这种树枝状大分子材料具有纳米级可控尺寸，有大量可修饰的结合位点，且合成方法简单，具有低毒性和低成本、高质量等主要特点。因此，选择PAMAM来进一步降低比色试纸的LOD。结果表明，对金黄色葡萄球菌的LOD为2.49 CFU/mL。3种不同浓度下RSD 分别为 3.89％、5.05％和 4.08％。 （3）在放大AuNPs信号的基础上，提出了一种新型的、基于自加热的RPA集成侧流生物传感器，用于高效检测大肠杆菌。由于氧化钙的自加热包为RPA提供了稳定的最佳外部温度，避免了使用外部电源或复杂的温度控制装置。另外，可以通过拍照的方式将侧流条测试线的色彩强度上传到ImageJ软件，通过分析灰度值实现EHEC O157∶H7的定量检测。结果表明，该传感器对EHEC O157∶H7的视觉检出限为1×102 CFU/mL,分析检出限为36.23 CFU/mL，可在30 min内快速检测。此外，该生物传感器对特定细菌表现出特殊的特异性和高准确性。3种不同浓度的 RSD 分别为 5.39％、3.85％和 4.82％。
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