摘要
外泌体是一类由细胞分泌的，尺寸在30-150 nm之间的胞外小囊泡，广泛存在于血液、尿液、唾液以及乳汁等生物体液中，在各类生理过程中发挥重要的作用。外泌体的内容物和结构很大程度上反映了亲代细胞的生理信息。因此，以外泌体为研究对象的液体活检技术，在疾病的病理研究、诊断、监测和预后方面具有重要的意义。近年来，外泌体所携带的生物标志物信息在临床研究中引起广泛关注，针对外泌体生物标志物的基础和应用研究获得巨大进展，研究覆盖蛋白质组学、代谢组学和基因组学等多个领域。与此同时，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)因其在检测生物分子的应用中具有高灵敏度、高通量等优势，被广泛应用于外泌体生物标志物的研究中。基于MALDI-TOF MS的外泌体生物标志物的研究策略主要分为两种，其一是建立于蛋白质组和代谢组研究基础上，进行生物标志物筛选和通路讨论。该方法的难点在于，受外泌体异质性的影响，低丰度生物标志物的信号易被高丰度生物分子信号压制，从而造成信息遗漏。另一方面，针对已知的疾病生物标志物，则可以通过使用化学或生物亲和方法富集外泌体生物标志物，利用功能化的质量标签探针特异性识别生物标志物，将生物标志物信号转化为质量标签信号，实现对生物大分子的高灵敏度、原位、多通路检测。这类生物标志物信号放大检测所面临的挑战在于兼顾检测方法灵敏度，以及检测方法的动态范围与实际样本目标物质浓度重叠度两个要点。本论文的工作以外泌体为检测对象，MALDI-TOF MS为检测手段，开展外泌体生物标志物的检测方法研究:首先针对已知的外泌体携带的疾病生物标志物，开展了基于MALDI-TOF MS的原位信号放大技术的定量分析方法研究;接着针对外泌体携带的小分子代谢物展开研究，通过MALDI-TOFMS对外泌体代谢指纹图谱的提取，结合机器学习建模，建立了快速且高通量的外泌体代谢组学研究方法，并实现了对健康对照和疾病患者的区分。 具体的研究包括以下内容: 第一章是文献综述，从外泌体的分离纯化和表征检测两方面，对外泌体的最新研究手段和成果进行了综述。从外泌体的基本概念出发，阐述了外泌体在生理过程中的重要作用，进而说明了以外泌体为研究对象，进行基础研究和应用研究的重要性。本章重点介绍了外泌体分析方法的开发中，以MALDI-TOF MS为主要分析手段的研究进展，阐述了 MALDI-TOF MS的工作原理、优势和应用范围，介绍了该方法在外泌体的各类生物标志物检测和代谢组学分析领域的发展前景。结合上述背景，最后阐明了本文的选题意义。 在第二章中，我们基于MALDI-TOF MS检测手段，发展了一种对外泌体生物标志物进行原位信号放大定量检测的分析方法。建立在本课题组开发的外泌体分离纯化技术的基础上，首先从胰腺癌细胞系培养基中提取了表面带有生物标志物酰肌醇蛋白聚糖1（GPC1）的模型外泌体，同时设计并合成了 GPC1抗体与信号分子修饰的纳米金颗粒作为信号放大探针，通过抗原-抗体相互作用，特异性地识别表达GPC1的外泌体，继而利用MALDI-TOF MS以及内标探针实现原位信号放大检测，建立用于定量的标准曲线，实现了 6个数量级的动态范围和低至每微升71个颗粒的检测限，为实际样品的检测建立可靠的基础。接着,我们将该方法应用于从人外周血的血浆中提取的外泌体，分析结果显示，胰腺癌患者组和健康对照组，以及不同肿瘤负荷程度的患者之间存在明显的区分度,展现了该方法在胰腺癌患者的区分和病情监测方面的应用潜力。 在第三章的工作中，我们首先基于外泌体分离纯化技术与MALDI-TOF MS检测技术得到外泌体的代谢指纹谱，通过结合正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA）机器学习模型建模方法，建立了尿源性外泌体的代谢组学分析方法，并应用于系统性红斑狼疮患者和健康人群的尿源性外泌体代谢指纹谱分析研究。我们通过机器学习方法建立的模型，受试者特征曲线（ROC）的曲线下面积达到1.00,聚类分析准确度达到90.32％,表明该模型能够实现对系统性红斑狼疮组和健康对照组的高准确度区分。我们基于该模型的统计结果，筛选出了 29个在系统性红斑狼疮组和健康对照组具有差异化表达的信号峰，并分析推测了潜在的生物标志物和相关代谢通路信息。该方法具有高通量、快速和准确度高的特点，揭示了代谢组学研究应用于疾病临床检测的广阔前景。 在第四章，我们针对多种疾病的外泌体生物标志物miRNA-146a设计了基于MALDI-TOF MS的信号放大定量检测方法。我们首先设计了一种与miRNA-146a能够发生碱基互补配对的DNA序列，将其修饰于携带质量标签的纳米金颗粒上作为识别探针，并对识别miRNA-146a后产生的信号探针效果进行模拟，初步证明了构建的探针应用于定量检测方法的可行性。接着，我们对不同浓度的miRNA-146a标准品进行基于MALDI-TOF MS的信号放大定量检测，得到了miRNA-146a定量标准曲线，R2=0.9970,在未来的相关疾病，如神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病以及癌症的筛分研究中具有应用潜力。 第五章总结了论文的研究进展，回顾了建立的检测方法的优势以及改进的方向，并对基于MALDI-TOF MS的外泌体生物标志物分析方法的未来研究方向进行了展望。
NETL