摘要
帕金森病(Parkinson''s disease,PD)目前是全球第二常见的神经退行性疾病，是导致神经系统残疾的原因之一。目前，全球患病率达600多万，2050年可能达到1200万人。PD的主要临床表现是震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态障碍等，现今临床主要治疗手段为药物治疗，然其使用后可能带来的较大的副作用，严重危害了患者的生活质量。 近些年，PD的发病人数逐年增多，相关研究的也逐渐深入，有研究表明PD与突触可塑性异常密切相关，可能与PD模型黑质多巴胺能(Dopamine,DA)神经元丢失后有关，其中直接中棘神经元过度激活使得突触发生可塑性改变。谷氨酸(Glutamic acid，Glu)在调节大脑中的神经发生、神经元突触生长及存活中起着关键作用。Glu受体功能受损将导致突触可塑性丧失和神经元损伤。前期研究表明，谷氨酸代谢性受体 5(Metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)能够参与调节突触可塑性，已被证明与PD密切相关。临床研究证实，针灸对PD患者的行为异常如静止性震颤、肌强直和运动迟缓有明显的缓解作用，且在其他疾病的研究中证明电针对mGluR5有一定调控作用。 研究目的： 采用SPF级雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2,3，6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)构建PD模型。观察电针对PD小鼠行为学、黑质中相关蛋白水平、Glu受体信号通路的调节作用，初步揭示PD异常突触可塑性机制，探究电针干预PD的可能作用机制，以期为临床治疗PD提供理论基础。 研究方法： 第一部分： 本实验采用雄性C57BL/6小鼠，分为Ctrl（对照组）、MPTP（模型组）、EA（电针组）、L-dopa（左旋多巴组，阳性对照），拟构建MPTP的PD模型，选择“风府”、“太冲”、“足三里”三个穴位对EA组进行电针刺激，通过旷场实验、异常不自主运动评分，观察电针干预对各组小鼠行为学作用，是否改善PD模型小鼠的运动障碍。 第二部分： 本实验采用雄性C57BL/6小鼠，分为Ctrl、MPTP、EA、L-dopa四组，拟构造PD小鼠模型，选择“风府”、“太冲”、“足三里”三个穴位对EA组进行电针刺激，通过免疫组化法观察各组小鼠中脑黑质TH及中脑黑质mGluR5含量变化，除此以外，采用蛋白印迹法检测小鼠黑质中mGluR5通路相关蛋白含量变化。观察电针干预PD是否通过mGluR5这一关键靶点。 第三部分： 本实验采用雄性C57BL/6小鼠，分为Ctrl、MPTP、EA、CHPG（模型+激动剂组）、CHPG+EA（模型+激动剂+电针组）五组。实验第二部分得出mGluR5可能是电针干预PD的重要靶点结论，故本实验选择对CHPG组小鼠脑立体定位注射mGluR5激动剂CHPG,CHPG+EA组脑立体定位注射mGluR5激动剂CHPG基础上加“风府”、“太冲”、“足三里”穴位进行电针干预。通过行为学检测、免疫组化、实时荧光定量及蛋白免疫印迹观察在CHPG的影响下，电针是否还能发挥对PD模型小鼠的干预作用，验证mGluR5是否为电针改善PD的关键靶点。 研究结果： 第一部分： 1电针改善PD小鼠运动功能障碍 与Ctrl组相比，MPTP组小鼠在旷场实验中表现出了主动运动的总路程、主动运动时间的明显减少（P＜0.01）;与MPTP组相比，EA组小鼠在旷场实验中表现出主动运动的总路程、主动运动时间都有了显著的提高（P＜0.01）;L-dopa组旷场实验中主动运动的总路程、主动运动时间与EA组相比并无明显差异（P＞0.05）。说明电针改善了 PD小鼠的运动障碍。 2电针改善PD小鼠行为学异常 与Ctrl组相比，MPTP组小鼠相继出现毛发变脏，主动活动减少，行走困难等表现，行为学评分显著升高（P＜0.01）;与MPTP组相比，EA组异常行为学减少，行为学评分显著下降（P＜0.01）;L-dopa组与EA组相比并无明显差异（P＞0.05）说明电针改善PD小鼠行为学异常。 第二部分： 1电针改善PD小鼠中脑黑质TH阳性信号表达 MPTP组小鼠中脑黑质阳性TH表达显著降低（P＜0.01），EA组中脑黑质TH阳性信号明显增加。 2电针对PD小鼠中脑黑质mGluR5的影响 通过免疫组化法观察各组小鼠中脑黑质中mGluR5表达，发现在MPTP组小鼠中脑黑质mGluR5表达明显上调（P＜0.01）;EA组小鼠中脑黑质mGluR5显著减少（P＜0.01）。推测其可能是电针干预PD突触可塑性的重要靶点。 3电针对PD小鼠中脑黑质中mGluR5通路的影响 在实时荧光定量及蛋白印迹法检测中发现，与Ctrl组相比，MPTP组小鼠中脑黑质内p-ERK、p-CREB、BDNF的蛋白含量明显下降（P＜0.01）,ERK、CREB、BDNF 相对 mRNA 水平明显下降（P＜0.01）;与MPTP组相比，EA组小鼠中脑黑质内p-ERK、p-CREB、BDNF的蛋白含量表达明显上升（P＜0.01），ERK、CREB、BDNF相对mRNA水平明显上升（P＜0.01）;与EA组相比，L-dopa组小鼠中脑黑质内p-ERK、p-CREB、BDNF的蛋白含量均无明显差异（P＞0.05）,ERK、CREB、BDNF的相对mRNA水平均无明显差异（P＞0.05）。说明ERK-CREB-BDNF可能是电针调控PD小鼠突触重塑的作用机制 第三部分： ERK/CREB/BDNF是电针调控PD小鼠突触重塑的作用机制 利用mGluR5激动剂CHPG进行验证，结果显示，CHPG组、CHPG+EA组行为学评分及旷场实验结果与MPTP组相比有统计学意义(P＜0.01)。证明mGluR5可能是电针治疗PD的重要靶点。 免疫组化中发现，CHPG组及CHPG+EA组与MPTP组小鼠相比，mGluR5表达更加上调(P＜0.01);在实时荧光定量及蛋白印迹法检测中发现，与MPTP组小鼠相比，CHPG组及CHPG+EA组小鼠中脑黑质内mGluR5、p-ERK、p-CREB、BDNF的蛋白含量有统计学差异(P＜0.01)，mGluR5、ERK、CREB、BDNF 的相对 mRNA 水平有统计学差异(P＜0.01)。说明ERK-CREB-BDNF可能是电针调控PD大鼠突触重塑的作用机制。 研究结论： 1 电针“风府”、“太冲”、“足三里”穴可以改善PD小鼠的运动功能障碍及行为学异常 2 mGluR5可能是电针“风府”、“太冲”、“足三里”穴改善PD的突触可塑性的关键靶点。 3 mGluR5/ERK/CREB/BDNF通路可能是电针“风府”、“太冲”、“足三里”穴调控PD小鼠突触可塑性的具体作用机制。
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