摘要
目的: 本研究通过高脂饲料喂养构建胰岛素抵抗大鼠模型，旨在观察电针对胰岛素抵抗大鼠的干预作用，并从“标本配穴”电针法调控AMPK/Drp1通路变化角度阐明电针抑制线粒体过度裂变，改善胰岛素抵抗、糖尿病及其并发症可能存在的机制，为针灸防治胰岛素抵抗及其相关疾病提供实验依据。 方法: 1.胰岛素抵抗大鼠造模及分组:5周龄SPF级雄性SD大鼠50只，在SPF级动物房适应性喂养1周，采用随机数字表法对大鼠进行分组，分为LFD组（10只）和HFD组（40只）。LFD组予以普通饲料（粗蛋白20.34％、粗脂肪4.14％、粗纤维4.66％、粗灰分8.46％、其他62.4％）喂养，HFD组以高脂饲料（粗蛋白18.28％、粗脂肪25.81％、粗纤维2.46％、粗灰分2.07％、碳水化合物40.16％、其他11.22％）喂养，喂养8周后，检测大鼠FBG、FINS、IPGTT,计算HOMA-IR,以大鼠空腹血糖升高不明显或轻度升高，出现糖耐量异常，胰岛素抵抗指数明显升高视为IR模型构建成功。造模完成后，随机将LFD组的6只大鼠设为空白组，并随机将HFD组的大鼠分为模型组、电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组，每组6只。 2.干预:空白组继续以低脂饲料喂养，不采取其他干预措施;其余4组均以高脂饲料进行喂养，模型组不做其他任何干预措施，电针组和电针+抑制剂组大鼠选择下肢同侧足三里、丰隆以及腹部的中脘、关元给予电针治疗，用0.25×25mm毫针进行针刺，连接电针治疗仪，接线方式为同侧负极接“足三里”穴，正极接“丰隆”穴，另一组电针负极接“关元”，正极接“中脘”，足三里和丰隆两穴左右交替使用。电针治疗仪参数设为（2 Hz，疏密波，强度为1 mA），每次持续治疗15 min,两日1次，连续治疗8周;抑制剂组给予AMPK抑制剂（2 mg/ml Compound C溶液，腹腔注射，20 mg/kg），隔日1次，持续给药8周;电针+抑制剂组于每次进行电针处理30 min前给予AMPK抑制剂，干预方式及药物用量同电针组和抑制剂组。 3.药效学指标及机制研究:干预结束后检测所有大鼠FBG、FINS和IGPTTs,计算HOMA-IR，采用全自动生化分析仪检测血清Scr和BUN水平，苏木素-伊红染色法观察肾组织病理学形态结构，透射电镜观察肾组织超微结构的变化，实时荧光定量PCR法检测肾组织AMPK、Drp1、MFF、Fis1mRNA的表达，免疫蛋白印迹法检测肾脏组织中p-AMPK、AMPK、p-Drp1、Drp1、MFF、Fis1 蛋白的表达。 结果: 1.胰岛素抵抗模型构建成功 (1)各组大鼠葡萄糖耐受检测结果:LFD组与HFD组之间存在显著差异(P＜0.001)。 (2)各组大鼠胰岛素抵抗指数评估:HFD组大鼠的FBG、FINS和HOMA-IR都显著高于 LFD 组(P＜0.01，P＜0.001,P＜0.001)，提示造模成功。 2.电针改善IR大鼠的胰岛素敏感性 (1)干预后各组大鼠葡萄糖耐受检测结果:在注射前(0min)，各组大鼠空腹血糖组间无明显差异(P＞0.05)。各组大鼠血糖在注射30 min后达到高峰。与空白组比较，模型组IPGTTs AUC明显增大(P＜0.01);与模型组比较，电针组、电针+抑制剂组IPGTTs AUC下降(P＜0.01)，抑制剂组IPGTTs AUC增大(P＜0.05);与电针组比较，电针+抑制剂组IPGTTs AUC增大(P＜0.05)。 (2)干预后各组大鼠胰岛素抵抗指数评估:干预8周后，与空白组比较，模型组 FBG、FINS、HOMA-IR 均升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01);与模型组比较，电针组FBG、FINS、HOMA-IR均显著下降(P＜0.01)，但抑制剂组FBG、FINS无明显统计学意义，HOMA-IR升高(P＜0.05)，电针+抑制剂组FBG水平无明显统计学意义，FINS水平下降（P＜0.01），HOMA-IR显著下降（P＜0.01）;与电针组比较，电针+抑制剂组 FBG、FINS、HOMA-IR 均升高（P＜0.01，P＜0.05,P＜0.05）。 3.电针改善IR大鼠肾功能:与空白组比较，模型组Scr和BUN表达水平均显著上升（P＜0.01）;与模型组比较，电针组和电针+抑制剂组Scr和BUN表达水平均下降（P＜0.01），抑制剂组Scr和BUN表达水平均显著上升（P＜0.01）;与电针组比较，电针+抑制剂组Scr和BUN表达水平均上升（P＜0.05，P＜0.01）。 4.电针改善IR大鼠肾脏组织病理学形态变化 （1）HE染色结果显示:空白组肾小球结构基本正常;模型组肾小管管腔变窄，肾小管之间拥挤，肾小球上皮细胞肿胀、组织系膜扩张，基质沉积明显;电针组肾组织的上述病理状态较模型组明显改善;抑制剂组肾小管管腔狭窄，肾小管之间拥挤，肾小球肿胀变形，组织系膜扩张，基质沉积更加明显，病理状态较模型组更严重;电针+抑制剂组肾小球病理状态较电针组严重。 （2）透射电镜结果显示:空白组足细胞足突排列规则，足突之间间隙正常，基底膜厚度基本一致;模型组大鼠肾组织出现足突融合，部分足突脱落，基底膜增厚，细胞器损伤;电针组亚细胞结构基本接近于空白组，偶见足突融合，基底膜厚度基本一致;抑制剂组足突大量融合脱落，基底膜厚度明显增厚，细胞器严重损伤，损伤程度较模型组严重;电针+抑制剂组较模型组好转，基底膜部分增厚，足突部分融合。 5.电针通过AMPK/Drp1通路改善IR大鼠肾脏线粒体分裂 （1）干预后各组大鼠肾脏AMPK、Drp1、MFF、Fis1mRNA基因相对表达含量的表达:与空白组比较，模型组大鼠肾脏AMPKmRNA表达水平显著降低（P＜0.01），线粒体裂变相关因子Drp1、MFF、Fis1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）;与模型组比较，电针组和电针+抑制剂组大鼠肾脏AMPK mRNA表达水平明显升高（P＜0.01，P＜0.05），线粒体裂变相关因子Drp1、MFF、Fis1mRNA表达水平降低（P＜0.01,P＜0.05），抑制剂组大鼠肾脏AMPK mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），线粒体裂变相关因子Drp1、MFF、Fis1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）;与电针组比较，电针+抑制剂组大鼠肾脏AMPKmRNA表达水平显著降低（P＜0.01），线粒体裂变相关因子Drp1、MFF、Fis1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。 （2）干预后各组大鼠肾脏 AMPK、p-AMPK、Drp1、p-Drp1、MFF、Fis1蛋白相对表达量的结果比较:与正常组比较，模型组大鼠肾脏p-AMPK相对表达量明显增加（P＜0.01），线粒体裂变相关因子p-Drp1、MFF、Fis1相对表达量明显减少（P＜0.01）;与模型组比较，电针组和电针+抑制剂组大鼠肾脏p-AMPK相对表达量明显增加（P＜0.01），线粒体裂变相关因子p-Drp1、MFF、Fis1相对表达量明显减少（P＜0.01），抑制剂组大鼠肾脏p-AMPK相对表达量明显减少（P＜0.01），线粒体裂变相关因子p-Drp1、Fis1相对表达量明显增加（P＜0.01），MFF蛋白相对表达量无显著性差异（P＞0.05）;与电针组比较，电针+抑制剂组大鼠肾脏p-AMPK相对表达量减少（P＜0.05），线粒体裂变相关因子p-Drp1（P＜0.05）、MFF（P＜0.01）、Fis1（P＜0.05）蛋白相对表达量增加。 结论: （1）电针干预能够下调胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖、血清胰岛素表达水平，改善腹腔糖耐量异常和胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，改善IR状态下的机体代谢异常。 （2）电针干预能够下调胰岛素抵抗大鼠血清肌酐和血清尿素氮的水平，改善肾脏的组织形态，提高肾功能。 （3）电针干预能够通过激活AMPK，抑制线粒体分裂蛋白表达水平，减少肾脏线粒体碎片化，增强线粒体稳定性，从而达到改善胰岛素抵抗，提高血糖的作用。
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