摘要
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引发的一种急性、高度接触性传染病。自1996年我国大陆首次分离到PRRSV以来，该病毒已传播至全国各地，并不断发生重组变异，给养猪业造成了巨额的经济损失。时至今日，在临床实践中对PRRSV的治疗尚缺乏有效药物，因此开发针对PRRSV的药物具有非常重要的意义。 鉴于PRRSV属于单股正链RNA病毒，并且其蛋白结构与冠状病毒具有一定的相似性，因此从已报道的具有抗冠状病毒或RNA病毒功效的药物中，进行深入的筛选工作，以寻找抗PRRSV的候选药物。首先通过CCK-8法检测了不同药物在Marc-145细胞上的安全浓度区间。最终选取PSI-6206 0～1,000μM、GC376 0～100 μM、水飞蓟素0～100μg/mL、槐定碱0～50μg/mL、番茄碱0～25μM、迷迭香酸0～50μM、葛根素0～20 0 μM、Molnupiravir 0～75μM、紫苏叶提取物 0～0.0625 mg/mL、夏枯草提取物 0～0.031 25mg/mL和蒲公英提取物0～0.0039625 mg/mL。为了研究筛选的药物对PRRSV复制的影响，用PRRSV毒株GFP-TA-12感染细胞后加入不同浓度的药物，36h后观察荧光效果、检测PRRSV-N蛋白和TCID50。结果表明，PSI-6206、GC376、水飞蓟素、槐定碱、番茄碱、迷迭香酸、Molnupiravir、紫苏叶提取物和夏枯草提取物可以有效地抑制PRR SV在Marc-145细胞上的复制。为了研究PSI-6206、GC376、水飞蓟素、槐定碱、番茄碱、迷迭香酸对PRRSV的抑制是否具有广谱性，用TA-01、TA-02、CH1R毒株感染细胞后，加入药物作用细胞36h后检测PRRSV-N蛋白和TCID50。结果表明这6种药物对多种毒株都有抑制作用，具有广谱抗PRRSV作用。 为了进一步探究这6种药物抑制PRRSV复制的具体机制，研究了其对PRRSV生命周期的影响。结果表明，PSI-6206在复制阶段;GC376在内化和复制阶段;水飞蓟素在内化、复制和释放阶段;槐定碱在吸附、复制和释放阶段;番茄碱和迷迭香酸在吸附、内化、复制和释放阶段对PRRSV起到抑制作用。为了研发优势药物组方，根据药物作用PRRSV生命周期的不同阶段，选择了优势药物进行联合应用，分为高浓度组方 A 组:PSI-6206 500μM+GC376 70 μM,B 组:PSI-6206 500 μM+GC376 70 μM+Sily marin 50 μg/mL,C 组:PSI-6206 500μM+GC376 70 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridi ne 20 μg/mL,D 组:PSI-6206 500 μM+GC376 70 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 2 0 μg/mL+Tomatidine 20 μM,E 组:PSI-6206 500μM+GC376 70 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL+Tomatidine 20 μM+Rosmarinic acid 30 μM。低浓度组方 A 组:G C376 50 μM+Silymarin 50 μg/mL,B 组:GC376 50μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL,C 组:GC376 50 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL+Tomatidine 12.5 μM,D 组:GC376 50 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL+Tomatidine 1 2.5 μM+Rosmarinic acid 25μM。首先通过CCK-8法测定联合应用药物的安全性，在病毒感染细胞后加入组方药物作用不同时间，36h后观察荧光效果、检测PRRSV-N蛋白、检测 TCID50。结果表明，高浓度组方 D 和 E，D:PSI-6206 500 μM+GC376 70 μM+Sil ymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL+Tomatidine 20 μM,E:PSI-6206 500 μM+GC37 6 70 μM+Silymarin 50 μg/mL+Sophoridine 20 μg/mL+Tomatidine 20 μM+Rosmarinic acid 30 μM。低浓度组方 A:GC376 50 μM+Silymarin 50 μg/mL 可以显著抑制 PRRSV 的复制。 综上所述，本研究以多种抗病毒药物为研究对象，在体外细胞水平探究药物对PR RSV复制的抑制作用。筛选出抗PRRSV的药物，研究其作用机制并根据其不同作用阶段，选择优势药物进行联合应用，开发出优势组方为抗PRRSV药物研发提供了理论支撑。
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