摘要
目的： 探讨肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)的耐药性及其与生物膜强度之间的关系；明确黄连素对KP的 Ⅰ 型、Ⅲ 型菌毛和生物膜形成的影响。 方法： 1. 复苏 2018 年 10 月至 12 月间河南省中医院检验科分离、保存的 KP，使用VITEK-2 Compact 微生物药敏分析系统进行药敏实验，根据耐药性特征分为多药耐药KP（Multidrug Resistant KP，MDR-KP）和非多药耐药KP（Non-Multidrug Resistant KP， Non-MDR-KP）。采用结晶紫半定量法测定KP的生物膜形成情况，比较MDR-KP和Non-MDR-KP间生物膜形成能力的差异，分析KP耐药性与生物膜形成之间的关系。 2. 采用微量肉汤稀释法测定黄连素对 KP 的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration ，MIC），结合生长曲线分析黄连素对KP的体外抑菌效果。设置不同浓度黄连素组，采用结晶紫半定量法、XTT减低法、BCA蛋白定量法、蒽酮比色法和荧光染色法研究黄连素在KP生物膜形成过程中对生物膜总量、膜内细菌活性、生物膜蛋白质、多糖含量及形态结构的影响；采用结晶紫半定量法、XTT 减低法检测黄连素对KP成熟生物膜和膜内细菌的清除作用。 3. 通过细菌粘附实验研究黄连素对KP粘附作用的影响；利用甘露糖敏感性血凝实验和甘露糖抵抗性血凝实验测定黄连素对 KP 的 Ⅰ 型和 Ⅲ 型菌毛表达量的影响；通过RT-PCR检测黄连素对KP的 Ⅰ 型 和 Ⅲ 型菌毛相关基因mRNA表达的调控作用。 结果： 1. 共复苏77株KP菌株，对氨曲南、哌拉西林、一、二代头孢菌素类和头孢曲松类的耐药率达到 50%以上，对头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素和喹诺酮类的耐药率在40%~50%之间，对美罗培南、亚胺培南的耐药率均为20.78%。MDR-KP和生物膜阳性KP的检出率分别为62.34%和80.52%，MDR-KP的生物膜形成能力强于Non-MDR-KP （P＜0.05）。形成中/强生物膜的菌株对氨曲南、复方新诺明、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率明显高于无/弱生物膜形成的菌株（P＜0.05）。 2. 黄连素对KP的MIC为2048 μg/mL，对KP的体外生长曲线呈剂量依赖性抑制作用。黄连素组KP生物膜形成总量、生物膜内细菌活性、生物膜中蛋白质和多糖含量较对照组均明显降低（P＜0.05），并且随黄连素浓度增加，降低程度越明显（P＜0.05），其中1/2MIC黄连素在第24 h对生物膜内细菌活性的抑制率最高，为87.78%。与对照组相比，1/8 MIC 组KP生物膜结构无明显变化，但荧光强度有所降低；1/4 MIC、1/2 MIC 组生物膜结构完整性、荧光强度及细菌聚集程度均明显下降。黄连素处理 KP 成熟生物膜后，生物膜总量及膜内细菌活性菌明显降低，并且随黄连素浓度增加，降低程度越明显（P＜0.05），1/2 MIC黄连素对生物膜内细菌活性的清除率可达到 61.86%。 3. 黄连素组KP在试管表面的粘附量较对照组明显减少（P＜0.05），且不同浓度黄连素组间细菌粘附量的差异具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，黄连素组KP使豚鼠红细胞和单宁酸化红细胞凝集所需的最低菌量均显著增加（P＜0.05），且 Ⅰ 型和 Ⅲ 型菌毛结构基因fimA、fimH、mrkA、mrkD及调控基因fimK、mrkH的表达水平均显著降低（P＜0.05）。 结论： 1. KP 临床分离株具有较高的抗生素耐药率和较强的生物膜形成能力，MDR-KP的生物膜形成能力明显强于Non-MDR-KP，中/强生物膜的形成可导致KP对多种抗生素的耐药性增强。 2. 黄连素能通过下调KP 的 Ⅰ 型和 Ⅲ 型菌毛结构基因fimA、fimH、mrkA、mrkD以及调控基因fimK、mrkH的表达减少 Ⅰ 型和 Ⅲ 型菌毛表达量，降低KP的表面粘附能力，进而有效抑制KP生物膜形成。
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