摘要
目的：中华雪胆（ Hemsleya chinensis Cogn. ex Forbes et Hemsl）是葫芦科（ Cucurbitaceae）雪胆属植物，块根入药，具有清热解毒、消肿利湿的功效。在我国西南地区常用于治疗牛羊等家畜乳腺炎及腹泻等疾病。葫芦烷型三萜类化合物是雪胆属植物的特征性成分。但目前针对中华雪胆化学成分的研究不足，临床用药理论依据不够充分。亟待阐明中华雪胆中系列葫芦烷型四环三萜的结构类型，发现结构新颖、活性显著的抗炎活性成分。为明确中华雪胆抗炎的药效物质基础，发现结构新颖、活性显著的抗炎活性成分。 方法：中华雪胆 (19) Kg，采用 70%乙醇回流提取，浸膏用乙酸乙酯-正丁醇萃取，得到不同的萃取部位，采用 HPLC-DAD、UPLC-MS 结合TLC 色谱法追踪葫芦烷型四环三萜，分别采用硅胶柱色谱、ODS 柱色谱、Sephadex LH-20 凝胶柱色谱、MCI 中压制备、Flash 快速制备、半制备HPLC 等多种现代色谱分离技术进行目标成分的分离与纯化。以单体化合物的核磁共振数据（ 1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY）为基础，综合应用 UV、IR、HRESIMS 等多种光谱学方法，结合文献解析化合物的结构。采用 Discovery Studio 高通量虚拟筛选技术，对中华雪胆的主要化合物与炎症通路相关蛋白进行分子对接，预测化合物的抗炎活性。采用 MTT 法检测化合物的细胞活力，进一步在安全给药浓度下，采用 Griess 法检测 LPS 诱导 RAW264.7 细胞产生的 NO水平，对化合物的抗炎活性进行验证。 结果：根据理化性质和现代波谱学方法从中华雪胆的活性部位中共分离鉴定了 36 个化合物，包括：6 个结构新颖的葫芦烷型化合物， hemchinins A-F (1-6)；13 个已知葫芦烷型四环三萜类化合物分别为：雪胆乙素（7），雪胆甲素（8），scandenogenin A（9）， scandenogenin B（10）， jinfushanencins F （11）， 23,24-dihydrocucurbitacin B （12）， 23,24-dihydroisocucurbitacin B（13），22-deoxy-22-hydroxy-25-deacetoxy-cucurbitacin B （14），2β,16α,2-R-trihydroxy-10α,17α-cucurbit-5,25-dien-3,11,22-trione（15）， dihydrocucurbitacin E（16），23,24-dihydrocu-curbitacin D（17），isocucurbitacin R（18）， jinfushanencins A（19）；14 个葫芦烷型四环三萜苷类化合物，分别为：jinfushanosides G （ 20），carnosiflosides Ⅱ（21），hemslepensides Ⅰ（22）3-O-β-D-glucopyranosyl-3β,27-dihydroxycucurbita-5,24(Z)-diene-11-one-27-O-β-D-glucopyranoside （23），hemsleyaoside M（24），carnosiflosidesⅠ（25），carnosiflosides Ⅲ（26），hemslepensides H（27），xuedanoside H（28），hemslepenside A（29），scandenoside R1（30），scandenoside R2（31）3β,11α,26-trihydroxy-cucurbita-5,24(E)-diene-3-O-β-D-glucopyranosyl-26-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-α-L-arabinoside（32），scandenoside R5（33）；3 个其他类化合物，分别为：ligballinol （ 34），异嗪皮啶-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（ 35），4,5-dihydroblumenol （ 36）。采用 Discovery Studio 高通量虚拟筛选技术，对中华雪胆的主要化合物与炎症通路相关蛋白进行活性靶点预测，对接结果显示，化合物 12 与炎症通路相关蛋白 AKT 的结合能为-70.88；化合物 18 与蛋白 NLRP3 的结合能为-86.5；化合物 18与蛋白 ASC 的结合能分别为-70.76；化合物 18 与蛋白 caspase-1 的结合能为-77.69；化合物 16 与蛋白 Nrf2 的结合能为-104.42；化合物 18 与蛋白 OH-1 的结合能为-56.73。预测化合物 12、16 和化合物 18 通过调控相关蛋白的表达来发挥较好的抗炎活性。体外抗炎活性验证发现，几乎所有葫芦烷型四环三萜类化合物均具有一定的抗炎活性，其中化合物 13 和15在浓度为6.25 μM时，NO抑制率分别为 49.00 ± 0.05%和 48.40 ± 0.10%。 结论：本研究从中华雪胆乙酸乙酯和正丁醇部位共分离鉴定了 36 个化合物，其中 6 个为新化合物，化合物 1-2 为 C-16 和 C-23 位置有氧桥链接的五环三萜类化合物，并且我们分析了化合物 1-6 的生源合成途径。DS 软件分子对接结果提示葫芦烷型四环三萜类成分可能是通过抑制AKT、ACS、Caspase-1、NLRP3、Nrf2、OH-1 蛋白的表达来发挥抗炎作用。通过体外抗炎活性验证，发现葫芦烷型四环三萜类成分具有一定的抑制 NO 释放作用，提示这类成分可能是中华雪胆发挥抗炎传统功效的重要物质基础。本研究丰富了中华雪胆的化学信息库，为中华雪胆的化学药效物质基础研究及资源的开发利用提供了科学依据。
NETL