摘要
胡萝卜是世界十大蔬菜作物之一，富含胡萝卜素，具有很高的食用和经济价值。瓣化型细胞质雄性不育是胡萝卜商业化制种的主要途径，可培育出完全不育的一代杂交品种，但也限制了优异种源的共享。瓣化型细胞质雄性不育恢复系可打破这一利用屏障，但实现后代完全恢复的资源材料报道鲜少。本课题基于多年资源收集和分离，筛选出了1份恢复系材料17166C，并初步将Rf1定位于9号染色体上物理距离为1.02Mb两个InDel标记之间。本研究在此基础上扩大瓣化型不育系P25A和恢复系17166C所构建的F2群体，对育性恢复基因Rf1进一步进行精细定位，克隆相关候选基因，并进行功能分析，为深入研究瓣化型雄性不育恢复机制奠定重要基础，同时为有效利用优异不育种源提供技术支撑和理论依据。主要研究结果如下： 1.通过对恢复系17166C与5个高代不育系、2个引进品种（完全不育）杂交后代进行育性调查，结果表明17166C分别与P52A、Y22的杂交后代育性恢复比例为74%和99%，其它5个杂交后代的育性均100%恢复，这与先前研究结果一致，17166C中Rf1为显性基因，可对不同基因型瓣化雄性不育源实现有效育性恢复。 2.本研究以不育系P25A和恢复系17166C构建了包含363个单株的F2群体，在前期定位区间新开发了5个SNP标记，Rf1定位在SNP-3252457和InD-3487954之间，遗传距离为3.48cM，对应9号染色体上的物理位置为3.25Mb-3.48Mb，物理距离为0.23Mb。 3.Rf1定位区间内含有23个基因，结合候选基因功能注释分析，进一步明确候选区间内存在6个PPR基因。系统发育分析显示，6个PPR基因和拟南芥的育性恢复基因RPF2、RPF3聚为一类，其中LOC108201831（PPR1831）和RPF2进化关系最为接近，与其它PPR基因亲缘关系较远。通过对6个PPR基因克隆，发现LOC108201831在P25A和17166C亲本之间存在多处序列差异。进一步克隆了3份保持系和2份自交系的LOC108201831，序列与不育系P25A一致，不同于恢复系17166C，初步推测LOC108201831可能为Rf1的候选基因。 4.利用P25A的下胚轴作为外植体，在1mg/L2,4-D+1mg/L6-BA的B5培养基中进行愈伤诱导。将17166C中LOC108201831的CDS序列构建到pCAMBIA2300_35S_YFP-HA-revised表达载体上，通过农杆菌介导转化到P25A愈伤组织中，在50、75、100mg/L的Kana筛选下共获得了1032个阳性愈伤组织，阳性愈伤比例为87%。在B5培养基中诱导分化获得了153个再生植株，通过鉴定，获得了63个阳性株系，阳性比例为41%。 5.以恢复系17166C为阴性对照，过表达结果表明不同阳性苗的相对表达量为阴性对照的2倍到10倍不等。目前观察到的6株阳性苗的表型均为雄性不育表型，有待进一步的观察鉴定。
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