摘要
芳香硝基化合物及其衍生物作为难降解的有机污染物，广泛存在于染料、农药、制药等行业排放的废水中。苯环上具有强吸电子能力的硝基使芳香硝基化合物结构稳定难以降解，导致其在环境中持续积累污染环境与水资源，甚至对食品及食品原料造成不同程度的污染，引发食品安全风险。因此，寻找一种条件温和、环境友好的绿色催化降解芳香硝基化合物的方法具有重要意义。硝基还原酶可利用NAD(P)H实现对芳香硝基化合物和硝基杂环衍生物的还原催化，作用条件温和。然而，酶在催化过程中缺乏长期稳定性，分离和回收困难，为了提高生物酶催化剂的稳定性和回收性，对酶进行固定化处理。具有表面积大、孔径均匀可控、结构多样、较高稳定性以及可重复利用性等一系列特点的金属有机框架材料(MOFs)作为酶的“铠甲”，可以提升酶在极端环境中的稳定性，同时解决了游离酶分离和回收困难问题。 因此，本文针对芳香硝基化合物的绿色还原，对硝基还原酶NfsB进行克隆与表达，合成材料ZIF-8以及ZIF-90并对酶进行固定化处理，以提高其催化性能，为芳香硝基化合物的催化还原研究工作提供方法。进一步应用于化学-酶法级联反应，为糖链荧光成像与酰胺类药物的合成提供新思路,具体研究内容如下: (1)根据NCBI中提供的NfsB的来源及序列构建pET28a(+)-NfsB质粒，转化至大肠杆菌表达系统，经发酵表达获得重组酶，利用镍柱亲和层析对酶进行纯化。通过SDS-PAGE凝胶电泳得到大小为26kDa左右的可溶蛋白条带，验证NfsB在大肠杆菌表达系统中成功表达。利用TLC分析、动力学测试对NfsB的催化活性进行初步鉴定，结果表明NfsB具有良好的催化活性。 (2)为提高酶在极端环境下的稳定性，选择沸石型咪唑骨架材料(ZIFs)ZIF-8对NfsB进行固定化处理。对材料ZIF-8与复合材料NfsB@ZIF-8进行了合成探索，经一系列表征确定材料的成功合成。对复合材料NfsB@ZIF-8的催化活性与环境稳定性进行研究，NfsB@ZIF-8表现优异的催化活性，与游离酶相比具有更好的耐高温性能、耐酸碱性和耐有机溶剂性能，可应用于具有极端环境的工业生产。此外，NfsB@ZIF-8具有良好的可重复使用性，解决了游离酶难以分离回收的问题，可降低生产成本，是一种新型催化芳香硝基化合物的生物催化剂。 (3)粗酶液不需纯化的操作流程，具有较好的成本效益，对粗酶液Crude-NfsB的催化活性进行研究，结果表明Crude-NfsB表现较好的催化活性与较高的稳定性。为提高酶的重复利用能力，对Crude-NfsB进行固定化处理得到复合材料Crude-NfsB@ZIF-90,经一系列表征确定材料的成功合成。基于复合材料具有分离回收的特点，应用于化学-酶法级联反应。Crude-NfsB@ZIF-90催化含硝基的糖链为含氨基糖链，经离心分离后,反应液进一步与荧光标记物FITC原位偶联，为糖链提供荧光共轭物，对于标记、检测糖链具有重要意义。此外，Crude-NfsB@ZIF-90催化还原4-NP的反应液可以与含羧基化合物发生酰胺化反应，原位生成酰胺类化合物，例如4-AP反应上清液与冰醋酸经酰胺化反应生成对乙酰氨基酚，为镇痛解热药物对乙酰氨基酚的合成提供新思路。
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