摘要
Intelectin是一种糖结合凝集素，因识别并凝集细菌表面的呋喃半乳糖环在鱼类非特异性免疫应答中发挥着重要作用。海藻多糖是从海洋藻类中提取的多功能化合物，在免疫调节中表现突出，是潜在的免疫增强剂。本实验室前期研究中发现，团头鲂intelectin（MaINTL）可诱导巨噬细胞MaCXCL8的表达上调，而CXCL8是典型的中性粒细胞趋化因子。然而， MaINTL诱导巨噬细胞招募中性粒细胞的机制尚不清楚，因此本研究探究重组MaINTL蛋白（rMaINTL）介导团头鲂原代巨噬细胞招募中性粒细胞的分子机制和海藻多糖对巨噬细胞招募中性粒细胞的影响。为此，本研究筛选了诱导MaCXCL8表达的相关信号分子，并通过qRT-PCR和抑制剂阻断的方法检测了rMaINTL对巨噬细胞MaCXCL8的表达调控作用。然后，利用transwell趋化技术构建了巨噬细胞通过表达MaCXCL8介导的中性粒细胞趋化模型；通过原核表达、多克隆抗体制备和Tranwell实验证明rMaCXCL8通过MaCXCR1受体介导团头鲂中性粒细胞的趋化；此外，通过qRT-PCR和Western blot证明了海藻多糖对MaINTL具有诱导表达作用，探究了海藻多糖对团头鲂巨噬细胞的吞噬作用和巨噬细胞对中性粒细胞招募的影响，为疫苗和免疫增强剂的开发奠定理论基础。具体结果如下： （1）rMaINTL诱导团头鲂巨噬细胞MaCXCL8表达并介导中性粒细胞的趋化作用。rMaINTL诱导了团头鲂巨噬细胞CXCL8及相关信号分子AP-1、CREB和p38 MAPK的表达上调，而CREB和p38 MAPK的抑制剂阻断后，rMaINTL诱导的MaCXCL8表达受到显著抑制，表明CREB和p38 MAPK参与了MaINTL对巨噬细胞MaCXCL8的表达调控作用。此外，transwell趋化实验结果表明rMaINTL处理团头鲂巨噬细胞后的培养基上清液可显著诱导团头鲂中性粒细胞的趋化，上述结果表明rMaINTL可能通过诱导巨噬细胞MaCXCL8的表达进而招募中性粒细胞。 （2）MaCXCL8与MaCXCR1受体介导的团头鲂中性粒细胞趋化作用。氨基酸序列比对发现MaCXCL8是典型的CXC型趋化因子，在CXC基序前有DLR（Asp-Leu-Arg motif）基序，这可能和它的趋化活性相关。利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了重组MaCXCL8蛋白（rMaCXCL8），趋化实验结果表明rMaCXCL8蛋白浓度为12.5μg/mL时对团头鲂巨噬细胞和中性粒细胞的趋化活性最显著。此外，团头鲂幼鱼感染嗜水气单胞菌后， MaCXCL8在肝脏、脾脏、头肾、体肾组织中的表达量均显著上调；团头鲂巨噬细胞在嗜水气单胞菌感染或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）处理后，MaCXCL8的表达量也显著上调；免疫组化结果表明嗜水气单胞菌感染后MaCXCL8在主要免疫组织中的表达分布显著增多。上述结果表明MaCXCL8在团头鲂抵御细菌感染中发挥了重要作用。体外结合结果表明，重组MaCXCL8蛋白可与MaCXCR1合成多肽相互识别并结合。此外，利用MaCXCR1抗体封闭中性粒细胞表面的MaCXCR1受体后，趋化实验结果表明中性粒细胞的趋化数量显著下降，且中性粒细胞IL-10和TNF-a的表达量下降、而IL-1β和IL-6的表达量却上调。上述结果表明，MaCXCL8通过与MaCXCR1结合后介导团头鲂中性粒细胞的趋化作用。 （3）海藻多糖对中性粒细胞趋化作用的影响。海藻多糖（岩藻多糖和海带多糖）不仅可以诱导团头鲂肝脏细胞MaINTL的表达，而且对团头鲂巨噬细胞IL-1β和CXCL8的表达也有显著的诱导表达作用，但是对于巨噬细胞诱导的中性粒细胞的趋化并没有显著影响。推测其原因可能是海藻多糖诱导后CXCL8在蛋白水平上的表达上调不够显著，因此对中性粒细胞的趋化作用没有显著的影响。此外，海藻多糖通过MaINTL-Rac1-WASP信号轴显著增强了团头鲂巨噬细胞的吞噬功能。
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