摘要
我国棉花78.9%栽培面积分布于新疆地区，其产量占我国棉纤维总产量的87%。但是新疆棉花生产过程中存在土壤盐碱含量高、干旱气候发生频率高、水资源短缺等因素，严重限制了棉花生产。因此，通过挖掘并利用耐逆基因对棉花进行遗传改良，提高棉花耐盐、抗旱能力成为棉花分子育种的研究热点之一。在前人研究的基础上，本研究鉴定获得棉花SOS途径负调控基因GhGI并对其耐盐、耐旱功能进行初步研究。首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建突变体和转基因过表达的方式，创制ghgi突变体和过表达GhGI转基因棉花新材料，并通过分子鉴定、选育获得T2代转基因株系。通过NaCl和甘露醇模拟盐、干旱胁迫处理T2代转基因株系种子，研究转基因株系从萌发至幼苗生长期对盐和干旱的耐受性。同时转录组数据分析棉花主要GhGI基因的转基因材料耐逆分子机制，为利用GhGI基因改良棉花耐盐、耐旱性状奠定理论基础。具体研究结果如下： 1.通过分析棉花基因组数据和转录组数据，发现陆地棉基因组上存在4个拷贝GhGI基因，分别命名为GhGI-A02（Gh_A02G0645）、GhGI-A05（Gh_A05G2086）、GhGI-D02（Gh_D02G0690）、GhGI-D05（Gh_D05G2338）。同时，通过分析盐和干旱胁迫处理棉花转录组数据，推测植物在响应盐和干旱胁迫过程中对GhGI的表达受调控程度降低，进一步影响棉花SOS耐盐途径和耐旱能力。 2.利用四个GhGI基因第二个外显子的基因组保守序列，设计基因编辑靶位点并构建CRISPR/Cas9基因编辑载体。将基因编辑载体导入陆地棉HM-1之后，经过靶标位点序列分子鉴定和纯合选育获得6个T2代转基因株系，分别命名为CRI-18、CRI-19、CRI-20、CRI-22，CRI-23、CRI-24。通过对不同株系靶位点的PCR产物测序分析，表明CRI-18为GhGI-A05基因发生片段缺失编辑，记为CRI-18-A05。CRI-19、CRI-20、CRI-23、CRI-24为GhGI-A02和GhGI-D02同时发生片段缺失编辑。同时，分别将4个基因CDS序列与eGFP融合构建植物过表达载体并导入陆地棉HM-1。获得的转基因植株经过分子鉴定和纯合选育获得6个T2代转基因株系，通过qRT-PCR检测过表达株系中不同GhGI基因的表达水平，筛选获得了OE-29-D02、OE-41-A05、OE-67-D05和OE-68-A02四个高表达GhGI基因的株系。 3.利用150mMNaCl胁迫处理GhGI基因编辑株系和过表达株系进行表型鉴定，其中种子萌发后播种于150mMNaCl1/2MS培养基处理3周，5片真叶期幼苗利用300mMNaCl溶液处理2周。不同转基因植株表型观察表明基因编辑株系的株高和长势显著高于受体材料及过表达株系，证明GhGI敲除之后能够提高棉花对盐胁迫的耐受性。 4.利用200mM甘露醇胁迫处理GhGI基因编辑株系和过表达株系进行表型鉴定，其中种子萌发后播种于200mM甘露醇1/2MS培养基处理3周，5片真叶期幼苗不浇水干旱处理2周。通过对不同转基因植株表型分析，表明基因编辑植株高度和长势高于受体材料与过表达植株，结合转基因植株中游离脯氨酸含量分析结果证明GhGI基因可能负调控棉花对渗透胁迫的耐受性。 5.为了解析GhGI基因在棉花耐盐、耐旱过程中基因表达调控机制。在表型观察的基础上选择GhGI-A05基因编辑CRI-18-A05株系和过表达OE-41-A05号株系，利用RNA-seq技术分析150mMNaCl和200mM甘露醇胁迫处理3h和6h转基因棉花种子转录组。结果表明正常生长条件下种子转录组数据表明GhGI基因是棉花逆境响应负调控基因，利用CRISPR基因编辑敲除该基因后有益于棉花生长发育。NaCl胁迫处理转录组数据分析结果表明，CRI-18-A05转基因材料主要是通过上调ERD10、LEA14-A、PP2CA、AHG1、AIP1等逆境胁迫应答基因增加转基因植株的耐盐性；甘露醇胁迫处理转录组数据分析结果表明，CRI-18-A05转基因材料主要是通过上调ABI1、PP2CA、AIP1等逆境胁迫应答基因增加转基因植株的抵抗渗透胁迫的能力。 6.利用OE-41-A05过表达植株中融合表达的GFP蛋白及其抗体，免疫共沉淀GhGI-A05结合质谱分析，共获得了11个特异肽段的序列。同时，利用UniProt蛋白质库对11个肽段进行注释，获得了CIPK24/SOS2、脂质转运体、抗病蛋白、Actin、甲基转移酶、WRKY转录因子等候选互作蛋白。 综合本研究实验结果可以证明GhGI基因负调控棉花对盐碱和渗透胁迫能力，利用基因编辑获得的ghgi-a05转基因突变体材料耐盐、耐渗透胁迫能力强，在棉花耐盐、耐旱分子育种研究中具有潜在的应用价值。
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