摘要
2016年以来，我国多地区爆发一种由鹅星状病毒（Goose astrovirus, GoAstV）引起以内脏尿酸盐沉积为特征的鹅新发传染病，俗称鹅痛风病。该病主要在3周龄以内的雏鹅上发生，病程通常为7~10 d ，死亡率可高达 50% 。患病鹅表现为卧地不起、精神萎靡、食欲不振、拉白色稀便，耐过鹅生长和发育受到严重影响。剖解在胆囊、心脏、肝脏以及胃部等器官可见肿胀和尿酸盐沉积。近年来该病呈现流行趋势，严重阻碍了我国鹅养殖业的健康发展，造成了巨大经济损失。 目前，我国针对鹅痛风病防控主要依赖于卵黄抗体的注射治疗。然而，该方法需要多次注射，导致人工成本高、易造成各种病原体的扩散传播而带来额外的风险。同时由于缺乏适合鹅星状病毒生长增殖的体外培养系统，导致研发针对鹅星状病毒的传统灭活疫苗和减毒活疫苗较为困难。因此，寻求一种更为高效、安全可靠的新型疫苗是当前亟待解决的问题。鸭瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）是疱疹病毒科（Hepesviridae）、α-疱疹病毒亚科马立克病毒属（Mardivirus）成员，其基因组容量大，可插入多个外源基因，该病毒刺激免疫应答快，呈现出良好的免疫保护效果，同时可以在鸡成纤维细胞上培养，并将病毒粒子释放至上清中，制备简单，容易保存，是一个良好的病毒载体。 鉴于此，本研究构建了表达鹅星状病毒主要抗原Cap蛋白的重组鸭瘟病毒，对重组病毒增殖特性、外源蛋白表达、稳定性等生物学特性进行研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，本研究成功构建了表达鹅星状病毒Cap蛋白和Cap-HA2蛋白(HA2可帮助形成多聚体)的重组鸭瘟病毒，分别命名为Vac-Cap、Vac-Cap-HA2。 本研究利用原核表达系统制备了鹅星状病毒 Cap 蛋白，纯化后免疫小鼠，制备了多抗血清。使用此多抗血清作为一抗，通过间接免疫荧光的方法对重组病毒表达外源蛋白的情况进行鉴定，结果显示这两株重组病毒均能表达鹅星状病毒Cap蛋白，表达的Cap蛋白主要分布在细胞质中，与GoAstV自然感染后Cap蛋白的细胞分布相似。将两株重组病毒连续传10代后进行测序分析，并检测蛋白表达情况，发现传代重组病毒中插入片段无突变或缺失，外源蛋白的表达没有明显变化，表明该病毒至少可以稳定传10代。为比较两株重组病毒和亲本病毒在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的生长特性是否存在差异，分别将三种病毒以MOI = 0.001剂量接种CEF细胞，在接种后24 h、48 h、72 h、96 h时间点取样，滴定病毒滴度，绘制生长曲线，研究结果发现两株重组病毒Vac-Cap、Vac-Cap-HA2在各时间点的病毒滴度与亲本鸭瘟病毒无显著差异，在感染细胞72 h时，Vac-Cap病毒滴度达到105.75TCID50/100 μL， Vac-Cap-HA2病毒滴度达到106TCID50/100 μL，鸭瘟疫苗株Vac病毒滴度达到105.75TCID50/100 μL。 本实验成功构建了两株表达鹅星状病毒 Cap 蛋白的重组鸭瘟病毒，并对其生物学特性进行了研究，为鹅星状病毒新型重组病毒载体疫苗的研制提供了毒株基础。
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