植物乳植杆菌YZH81胞外多糖基因簇的鉴定及功能研究

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中文摘要：乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌生长代谢过程中分泌的一种碳水化合物，不仅具有良好的流变学性质和公认安全特性，越来越多的研究表明它具有明显的抗氧化活性及免疫调节生理功能。鉴于EPS的重要性，本研究从高产胞外多糖乳酸菌的筛选出发，开展了以下三个方面的研究。 (1)产胞外多糖乳酸菌的分离、筛选鉴定及EPS发酵条件的优化研究。本试验以动物肠道内容物及粪便为原料，MRS为分离培养基，筛选出253株乳酸菌。首先进行了凝乳试验进行初筛，随后对菌株进行EPS的提取，苯酚-硫酸法进行测定其含量，最终得到了9株高产胞外多糖的乳酸菌(116.00±7.93～308.00±8.85mg/L),其中，产量最高的一株菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为植物乳植杆菌，命名为YZH81。随后对YZH81产胞外多糖进行发酵条件优化，在培养温度、接种量、培养时间的单因素试验的基础上进行三因素三水平的正交试验，以发酵培养基中胞外多糖的含量为试验指标。由正交试验结果可知，最佳发酵条件组合为发酵时间32 h、接种量3％、发酵温度37℃。在此条件下，进行验证试验,测得胞外多糖产量为380.00±47.16 mg/L,较优化前(216.67±7.55mg/L)提高了 42.98％。 (2)开展了YZH81全基因测序及EPS合成相关基因簇的基因学分析研究。测序结果显示YZH81染色体长度为3193307 bp,有两个区域含有胞外多糖相关合成基因，命名为cps1和cps2。后者cps2与其他植物乳植杆菌同源(相似性高达94.75～99.62％)。而cps1基因簇，大小约14.55kb,包含14个基因，其功能注释与其他植物乳植杆菌基因簇的功能基因相符，如编码糖基转移酶、多糖生物合成蛋白、翻转酶等。因此，本研究推测cps1基因簇可能是一个植物乳植杆菌广泛存在的胞外多糖合成基因簇，但其功能尚未鉴定。 (3)为探究YZH81菌株cps1基因簇的功能，构建了cps1基因簇敲除突变株YZH81△cps1。以野生型YZH81菌株为对照，体外试验结果显示，敲除cps1基因簇导致YZH81的EPS产量、Caco-2细胞的粘附及粘附蛋白的表达量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力降低。此外，利用LPS诱导实验动物模型开展的体内试验发现，与YZH81组小鼠相比，YZH81△cps1组小鼠的肠组织损伤、促炎细胞因子水平显著降低(P＜0.05),免疫细胞数量增加(P＜0.05),表明携带cps1基因簇的YZH81有效减弱了 LPS诱导的肠上皮细胞促炎作用及抗氧化应激反应。综上所述，本研究筛选获得一株高产胞外多糖的植物乳植杆菌YZH81菌株，在其基因组上鉴定到一个新的胞外多糖基因簇cps1,该基因簇的存在可显著提高YZH81的DPPH自由基清除能力、增强菌株粘附肠上皮细胞的能力以及粘附蛋白基因的表达。与此同时，体内实验证明携带cps1基因簇的YZH81有效减弱了LPS诱导的肠上皮细胞促炎作用、抗氧化应激反应。以上工作初步阐释了YZH81菌株胞外多糖基因簇的特性，并为进一步研究植物乳植杆菌胞外多糖合成机制，以及植物乳植杆菌胞外多糖合成基因簇的多样性研究奠定基础。

作者：

赵芳

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关键词：

植物乳植杆菌胞外多糖生物合成基因簇功能鉴定

授予学位：

硕士

学科专业：

医物与医药（食品工程）

导师：

杨瑶；宦海琳

学位年度：

2023

学位授予单位：

南京师范大学

语种：

中文

中图分类号：

Q93