摘要
口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性传染病，主要感染牛，猪，羊等偶蹄动物，造成了巨大的经济损失。目前我国口蹄疫的防控主要以灭活疫苗免疫为主，但灭活疫苗在生产和应用中可能会引起散毒的安全隐患，因此出现了多种更安全的疫苗形式，如合成肽疫苗及病毒样颗粒疫苗等亚单位疫苗。随着蛋白工程的逐渐发展，又出现了以自组装蛋白为骨架制备的纳米颗粒（Nanoparticles,NPs）亚单位疫苗，相对于合成肽疫苗，纳米颗粒疫苗既保证了安全性，又能够展现抗原的构象表位，使其具有更优越的免疫原性，且制备工艺简单，稳定性强，具有广阔的发展前景。此外，为进一步提高疫苗的免疫效果，当前研究人员尝试利用不同的佐剂及免疫增强剂，其中细菌的鞭毛蛋白作为一种生物源性的免疫增强剂，可显著提升抗原免疫效果，而且鞭毛蛋白可和抗原蛋白融合表达，对目标抗原发挥时效性免疫具有促进作用。 本研究基于纳米颗粒的自组装特性和鞭毛蛋白的免疫增强作用，以天然自组装蛋白I301作为骨架，与O型FMDV主要抗原蛋白VP1及N端截短的鞭毛蛋白（N-terminusofflagellin,nFLiC）共价连接，利用含有小泛素样蛋白表达系统（smallubiquitinmodifier,SUMO）的质粒pSMA构建了两个重组表达质粒，即含有鞭毛蛋白的pSMA-VP1-I301-nFLiC（PVIF）和不含鞭毛蛋白的pSMA-VP1-I301（PVI），以期获得重组融合蛋白。之后进行表达纯化并组装为纳米颗粒，并对其稳定性及免疫原性等进行评价。 研究结果表明： 1.两个重组融合蛋白在大肠杆菌中均获得有效表达，但可溶性表达量较少，大多以包涵体表达的形式存在，通过包涵体复性纯化方法可获得高纯度目的蛋白。 2.将重组融合蛋白PVIF和PVI置于不同pH条件下进行酶切组装，通过透射电镜、纳米粒度仪等方法进行表征，发现在pH为7.0-8.0时组装最佳，获得所需纳米颗粒。 3.将纳米颗粒置于不同温度条件下处理，随着温度的增高，纳米颗粒溶解性逐渐降低，纳米粒径逐渐增大。之后将纳米颗粒和VP1蛋白单体样品置于37℃进行长时间放置并利用dotblotting定量分析剩余有效抗原，结果表明，PVIF和PVI纳米颗粒相对于VP1蛋白单体具有良好的稳定性和抗逆性。 4.将纳米颗粒及VP1蛋白分别与细胞进行不同时间孵育，通过westernblotting鉴定，发现纳米颗粒可被细胞成功摄取，且相同时间下的摄入量显著高于VP1蛋白单体。 5.利用纳米颗粒进行豚鼠免疫及攻毒实验，并进行特异抗体、中和抗体、细胞增殖实验及细胞因子检测，结果表明两种纳米颗粒均能产生特异抗体、中和抗体和较高水平淋巴细胞增殖反应，且上调相关细胞因子（IL-4,IL-12,TNF-α和IFN-γ）转录水平。攻毒后，纳米颗粒组最高获得了83%的理想保护效果。 综上所述，基于自组装蛋白设计获得的纳米颗粒，作为候选疫苗可产生特异免疫保护效果，为纳米颗粒在动物疫病防控领域的应用提供数据支撑。
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