摘要
骨缺损往往伴随不同程度的骨膜缺损，本研究以应用于骨膜替代为目的，基于仿天然骨膜结构和功能的研究思想，提出一种以蚕丝丝素为基础材料的人工骨膜——高分子量丝素/丝素-纳米羟基磷灰石-脱氢表雄酮双层纤维膜的构建方案。双层纤维膜的上层模仿天然骨膜的纤维层，将经菠萝蛋白酶脱胶法获得的高分子量丝素蛋白通过喷气静电纺丝技术制得高分子量丝素纤维膜，以改善再生丝素纤维膜的力学性能、延缓生物降解，持续为骨缺损的修复提供物理保护和结构支撑。双层纤维膜的下层模仿天然骨膜的形成层，是以高/低分子量共混的丝素蛋白、纳米羟基磷灰石和脱氢表雄酮为原料，采用喷气静电纺丝技术制备的丝素-纳米羟基磷灰石-脱氢表雄酮复合纤维膜。双层纤维膜的下层，利用共混丝素纤维膜的微/纳米构造，募集骨修复细胞，加速血管网络形成;利用纳米羟基磷灰石的骨诱导性能，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化;利用脱氢表雄酮增强纳米羟基磷灰石的骨诱导性能并促进成骨细胞生长，从而持续地为骨缺损的修复提供细胞、氧和养营养的供给。 首先，用菠萝蛋白酶将家蚕丝脱胶，脱胶丝经溴化锂溶液溶解后得到高分子量再生丝素蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和剪切粘度检测结果表明，经菠萝蛋白酶脱胶法制备的再生丝素蛋白的分子量约为134kDa,其分子量和粘度均显著高于经尿素和碳酸钠脱胶法制备的再生丝素蛋白。以甲酸为溶剂，通过喷气静电纺丝技术制备高分子量丝素蛋白静电纺纤维膜，测定膜的形貌结构、聚集态结构、拉伸性能和热水溶解性能。结果表明，菠萝蛋白酶脱胶法制备的高分子量丝素蛋白静电纺纤维膜，未经不溶化处理，浸渍于37℃水中振荡处理24 h后的热水溶失率仅约为1％,基本不溶于水。与尿素和碳酸钠脱胶法制备的丝素蛋白静电纺纤维膜相比，其拉伸断裂强度和断裂伸长率显著提高。 其次，将高/低分子量丝素蛋白按照不同的质量比进行共混，利用喷气静电纺丝技术制备高分子量/低分子量丝素蛋白共混的静电纺纤维膜。对膜的理化性能、体外降解性能及细胞黏附性能进行表征。结果表明，随着低分子量丝素蛋白占比的增多，纳米纤维直径减小，膜的拉伸断裂强度、断裂伸长率减小，热水溶失率显著增大，对骨髓间充质干细胞的黏附性能降低。高分子丝素蛋白大分子自组装后，形成大量沿纳米纤维轴向排列的直径约为39 nm的次级纳米纤维，是导致其静电纺纤维膜难溶于水的主要原因。随着共混纤维膜中高分子量丝素蛋白占的增多，膜的酶降解速率显著降低，抵御生物降解和维持纤维膜结构完整性的能力显著增强。高/低分子量丝素蛋白共混比例为100/0和75/25的丝素蛋白静电纺纤维经水溶液浸渍处理后，其表面暴露的次级纳米纤维、纳米级凹槽和纳米级孔洞可为细胞提供较大的铺展表面和丰富的黏附位点，是其能够促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖的重要原因。 再次，将丝素蛋白与纳米羟基磷灰石以不同比例复合，探究丝素/纳米羟基磷灰石复合比例对丝素-纳米羟基磷灰石复合纤维膜结构和力学性能的影响。研究结果表明，随着纳米羟基磷灰石占比的增多，复合纤维的直径增大，浸泡后的纤维表面粗糙程度增加。当丝素、纳米羟基磷灰石的复合比例为100/10时，与不含纳米羟基磷灰石的丝素蛋白静电纺纤维膜相比，膜的干、湿态断裂强度和断裂伸长率均显著提高。 最后，构建高分子量丝素/丝素-纳米羟基磷灰石-脱氢表雄酮双层纤维仿生骨膜。用扫描电子显微镜观察双层支架形貌，以磷酸盐缓冲生理盐水为介质测定双层纤维膜中脱氢表雄酮的体外释放性能，并通过体外培养骨髓间充质干细胞测试双层纤维膜的细胞相容性及成骨分化性能。结果表明，双层纤维膜在480h内能够持续释放脱氢表雄酮。脱氢表雄酮装载量为3.6× 10-6 mg/g的双层纤维膜上骨髓间充质干细胞的增殖速度和活力显著提高，并且能促进骨髓间充质干细胞的早期成骨分化。 本研究用菠萝蛋白酶脱胶法获得高分子量再生丝素蛋白，提高了丝素蛋白静电纺纤维膜的力学性能，延缓其降解速率。通过高/低分子量丝素蛋白共混制备出具有纳米级凹槽及微孔的纤维膜，能够显著促进骨髓间充质干细胞黏附和脱氢表雄酮的持续释放。所构建的高分子量丝素/丝素-纳米羟基磷灰石-脱氢表雄酮双层纤维膜具有良好的细胞相容性，并能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。这些研究结果为丝素蛋白基仿生骨膜的后续开发及临床应用提供了可靠的实验依据。
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