摘要
视觉是动物获取外界信息的一种重要感知，在动物的捕食、避敌、配偶选择及讯息传递等方面具有重要作用。哺乳动物为适应不同的感光生境，进化出多样的视觉感知能力。暗光环境下的物种（如地下生活的金毛鼹和裸鼹鼠）降低了对白天视觉的依赖，进而丢失感光色素，出现亮视觉的退行性进化;而亮光环境下的物种受到强烈的感光刺激,进化出独特的色觉能力，有利于其捕食和躲避敌害。有趣的是，灵长类动物进化出敏锐的三色性色觉以便于更好的选择食物资源。显然，哺乳动物在适应亮光和暗光环境的过程中，已经形成了显著的视觉差异。然而，此种差异下的分子进化机制还不清晰。鉴于此，本研究以亮光和暗光环境下活动的哺乳动物为研究对象，通过对视觉形成过程中较关键的视蛋白基因和感光转导通路蛋白相关基因进行分子进化分析，并对视蛋白SWS1和RH1展开功能验证实验，以期全面揭示亮光和暗光环境下哺乳动物视觉差异的分子机制。 视蛋白主要分为介导成像视觉的视觉性视蛋白（SWS1、LWS和RH1）和非成像视觉的非视觉性视蛋白（OPN3、OPN4和OPN5）两大类。视觉性视蛋白包含视锥蛋白和视杆蛋白，视锥蛋白（SWS1和LWS）在亮光环境下起作用，主要介导色觉的形成。SWS1有较宽的光谱敏感范围（360-440nm）,可感知蓝光和紫外以适应相应的亮光和暗光环境。视杆蛋白RH1在暗环境下起作用，对暗光有感光灵敏性，介导暗视觉的形成。非视觉性视蛋白包括OPN3、OPN4和OPN5,响应于外界光环境中辐照度总体的改变，通过调节瞳孔大小或改变角膜对光反射的方式，使得眼睛对外界的感光刺激接收达到最合适的程度，参与瞳孔光反射、昼夜节律等生理学反应。为了探究视蛋白相关基因在不同光环境（亮光和暗光）的哺乳动物中的进化模式，运用比较基因组学和生物信息学方法对55个哺乳动物的7个视蛋白相关基因（SWS1、LWS、RH1、OPN3、OPN4、OPN5和VSX1（与非视觉性视蛋白功能一致的视觉基因））进行分子进化分析。结果发现，视锥基因（SWS1和LWS）在活动于亮光环境的物种中显著地受正选择作用，且鉴定出的30个正选择位点位于视蛋白的关键功能域。视锥基因受正选择作用可能有利于哺乳动物提高色觉能力以适应其亮光生境。相反，视锥基因SWS1/LWS在暗光环境下的物种中（如犰狳、金毛鼹及鲸类等）发生假基因化;进一步的选择压力分析发现，它们在假基因支系上的功能约束已放松。视杆基因RH1的正选择信号主要分布在暗光环境下活动的物种，提示这些物种可能进化出更高的感光灵敏性。另外，视蛋白（SWS1、LWS和RH1）关键位点上的替代所预测的光谱蓝移主要出现在暗光环境下的物种中，如视蛋白SWS1,暗光环境下的物种均具有86F的特异氨基酸，导致光谱发生蓝移（最大吸收值下移80nm）,这可能有利于最大化的吸收光子以适应于短波长为主导的暗光环境。以上研究结果提示，活动于亮光和暗光生境的哺乳动物在长期的进化过程中，其视觉性视蛋白相关基因产生了相应的改变以适应所处的亮、暗光环境。非视觉性视蛋白相关基因（OPN3、OPN4和VSX1）在亮光和暗光环境下活动的物种中均鉴定出正选择信号，依据此类基因的生理学作用，其有利于动物接收最适的感光刺激以促使相应的视觉视蛋白响应于亮/暗光环境。 为了更全面的探讨亮光和暗光环境下视觉差异的分子机制，我们进一步对视觉形成过程中的转导通路蛋白相关基因（上游视锥蛋白激活以响应于亮光环境的视锥转导通路基因:CNGA3、CNGB3、GNAT2、GNGT2、PDE6C、GNB3、PDE6H;上游视杆蛋白激活以响应于暗光环境的视杆转导通路基因:CNGA1、CNGB1、GNAT1、GNGT1、GNB1、PDE6A、PDE6B、PDE6G)进行适应性进化分析。结果发现6个视锥转导通路相关基因在色觉全盲的物种（金毛鼹、犰狳、小须鲸、弓头鲸和抹香鲸）中发生假基因化，可能是这些物种适应于极端暗光生境的进化结果。选择压力分析显示，12个基因（80％,12/15）被检测到显著受正选择作用，其中视杆转导通路相关基因（CNGA1、CNGB1、GNAT1、GNGT1、PDE6A、PDE6B）的正选择信号主要分布在暗光环境下活动的物种中，而在亮/暗光环境下的物种中均有视锥转导通路相关基因（CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、GNB3、PDE6H）被检测到正选择信号，这可能与视锥基因SWS1感知蓝光和紫外以适应相应的亮光/暗光环境有关。需要指出的是，受正选择作用的视锥转导通路相关基因（CNGB3、GNAT2、PDE6H）出现在暗光环境物种的早期祖先节点上，这为早期哺乳动物具有紫外感知能力提供了新的证据支持。感光转导通路相关基因与视觉性视蛋白基因的进化模式保持一致，为亮光和暗光环境下物种的视觉差异提供更多的适应性证据支持。 已有研究鉴定出SWS1与RH1在视觉进化中的关键作用位点，如86/93/195。本研究鉴定其中的86和195位点显著受正选择，SWS1的86位点在活动于亮/暗光环境下的物种中分别为（Y/V/S）和F;RH1的195位点上，鲸类进化成独特的（S/T）。为了验证这些特异的氨基酸突变是否产生了适应性功能改变，我们进行最大吸收值检测和视黄醛释放速率测定。经研究证实，SWS1在360-390nm敏感区感知UV,390nm-440nm敏感区感知VS。在体外，将小鼠SWS1蛋白的86位点由自身的F突变为亮光物种特异的Y时，可使光谱最大吸收值由360nm升高到438nm,提示SWS1产生了适应亮光的功能改变。然而，将小鼠的86 F突变为亮光物种的另外两种氨基酸S与V时，光谱最大吸收值分别为368nm和361nm,提示这两种氨基酸替代并未产生感知功能的改变。相应地，将小鼠的93 T突变为亮光物种特异的Ⅰ时，光谱吸收值由360nm变为359nm,表明其未发生明显的改变。再将小鼠SWS1蛋白进行双突变时（即F86Y&T93I）,光谱的最大吸收值由360nm升高到437nm,但与单突变F86Y基本一致，以上提示T93I的替代同样不能产生感知功能的改变。虽然，本研究中86突变位点的V/S以及93位点的Ⅰ并未引起光吸收值的显著改变，但结合前人的研究（F86S &T93I和F86L&T93P&A114G替代发生时，最大光吸收值可由360nm升高到415或399nm）可以发现，这些突变位点或存在协同作用使光吸收值发生改变以适应亮光环境,这也提示本文中的正选择位点86（S/V）,114可能间接（与其它位点协同作用的方式）引起了功能的适应性转变。同样，我们对暗光环境下起重要作用的RH1基因进行功能验证。无论将牛的195H和273F分别突变为鲸类的S/T和啮齿类祖先的M,还是将抹香鲸的195T反向突变为牛的H,我们发现最大光吸收值与野生型无异，提示这两个位点的突变在最大吸收值上并不产生功能改变。然而，进一步对这些突变型进行视黄醛释放速率检测时，发现了显著的改变。将牛的195H分别突变为抹香鲸的T以及其他鲸类的S时，牛的视黄醛释放速率（野生型:21.82±1.25min）显著下降，分别为 14.94±2.34min 和 15.37±0.52min;后将抹香鲸的特异T突变为牛的H以及其它物种统一的K时，抹香鲸的视黄醛释放速率（野生型:18.31±0.24min）显著上升，分别为 23.16±1.46min 和 32.62±1.18min;以上结果表明195位点上的突变（H195S,H195T）引起了视黄醛释放速率的下降，即视黄醛的快速释放，提示其提高了对暗适应的响应速度，可使抹香鲸及其它鲸类很好的应对潜水过程中快速的光变化以适应此特殊的海洋活动方式。将牛的273F突变为啮齿类祖先节点特异的M时，牛的视黄醛释放速率显著下降为13.82±0.94min,同样加快了视黄醛与视蛋白的脱离，提示啮齿类祖先具有快速的暗适应能力来应对其可能的活动模式。通过对视蛋白SWS1和RH1展开功能验证，发现这些正选择位点上的氨基酸替代引起了功能的适应性改变。 综上，通过对22个视觉相关基因在55个哺乳动物中的分子进化分析以及视蛋白SWS1和RH1的功能验证，揭示了活动于亮光和暗光环境下的物种，在长期自然选择的作用下，其视觉相关基因具有显著不同的进化模式，产生了适应性功能改变，较全面地揭示出哺乳动物在亮光和暗光环境下视觉差异的分子机制,为哺乳动物适应性进化提供了视觉方面的基础资料。
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