摘要
纤维素作为目前地球上分布最广、含量最多的可再生生物资源。如何利用生物转化技术将纤维素物质高效地转化为能源物质从而缓解能源短缺和环境污染一直是人们关注的热点。纤维素酶是一类具有纤维素降解功能的酶总称，能够将结构稳定的纤维素降解为小分子糖类，便于被生物吸收利用，具有强底物特异性、催化速率快、反应条件低且对环境污染小等优点，因此利用纤维素酶对纤维素进行降解转化能源研究受到广泛的关注。早期人们认为只有细菌、真菌等微生物才能合成纤维素酶，动物体内自身没有合成纤维素酶能力，主要依靠消化器官内共生菌分泌的纤维素酶来降解纤维素，因此纤维素酶的研究主要集中在微生物。然而随着人们研究深入发现许多食草动物自身也能够合成并分泌纤维素酶降解消化纤维素类物质，并且内源性纤维素酶对动物摄食的纤维素物质的降解作用至关重要。中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）是我国主养的经济甲壳动物之一具有典型的杂食性甲壳类动物特征，既食动物，又食植物，即使饵料过剩，中华绒螯蟹也要摄食水生植物以满足营养多样化的需求。因此，有必要加强中华绒螯蟹对水生植物的消化吸收研究，分析不同饵料对中华绒螯蟹摄食消化的影响。 本实验以中华绒螯蟹为研究对象，首先通过投喂不同饵料，检测不同饵料喂养条件对中华绒螯蟹生长性能及消化酶活力的影响，再通过转录组测序对中华绒螯蟹内源性纤维素酶家族进行信息挖掘与分析；筛选关键基因，采用分子克隆方法获得内源性纤维素酶基因全长，揭示内源性纤维素酶的起源；采用荧光定量PCR技术分析内源性纤维素酶基因的时空表达规律以及不同饵料喂养条件下纤维素酶基因的mRNA表达丰度变化情况；最后将获得的基因在毕赤酵母表达系统中进行异源表达，对表达的蛋白进行相关酶学性质研究，进一步明确其在摄食植物性饵料中的功能作用，具体研究结果如下： （1）设置三组不同的饵料，分别是投喂伊乐藻的植物性饵料组、投喂商业饲料的配合饲料组和投喂冰带鱼的动物性饵料组，喂养中华绒螯蟹约一个月后，解剖分离出肝胰腺后进行石蜡切片，观察每组中华绒螯蟹肝胰腺组织结构，发现配合饲料组肝胰腺细胞结构正常，植物性饵料组中B细胞的转运泡较大，动物性饵料组则呈现较多的R细胞。采用DNS法测定肝胰腺β-1,4-内切葡聚糖酶活力，结果呈植物性饵料组gt;配合饲料组gt;动物性饵料组，且组间差异显著（Plt;0.05）。 （2）通过转录组测序对中华绒螯蟹进行内源性纤维素酶家族的信息挖掘与分析，使用在线软件dbCANHMMdbv9（http：//bcb.unl.edu/dbCAN2/index.php）对转录组测序得到的Unigene序列进行比对分析及信息注释，获得序列在CAZy数据库的相关信息，最终统计获得857个有注释信息的基因，有604条基因在GH家族中有注释，占比70.48%。将丰度最高的GH家族进行统计归类，发现淀粉水解酶所在家族GH13和GH31比对到的基因条数最多，其次是几丁质酶所在家族GH18和GH20，最后是纤维素酶所在家族GH5、GH9和GH16。 （3）从中华绒螯蟹转录组数据库中筛选到内源性纤维素酶（β-1,4-内切葡聚糖酶）基因序列信息，通过克隆得到该纤维素酶（EsGH9-1）的DNA和cDNA序列。最终获得长度为11679bp的DNA序列，由15个编码片段和14个非编码片段组成；cDNA长度为2044bp，预测有一个1743bp长的开放式阅读框架，翻译氨基酸580个，具有糖基水解酶第9家族的典型催化功能域。利用RT-PCR分析了EsGH9-1的组织分布与不同发育时期的表达特征，结果表明：EsGH9-1主要分布在肝胰腺组织，在大眼幼体期和和仔蟹早期高表达。不同饵料条件下，EsGH9-1相对表达量在植物性饵料组显著上调，与β-1,4-内切葡聚糖酶活性趋势相一致，推测EsGH9-1参与纤维素的消化与分解。 （4）采用真核表达载体pPICZαA构建真核表达体系并在野生型毕赤酵母（Pchiapastoris）菌株X33中诱导表达中华绒螯蟹纤维素酶基因EsGH9-1的融合蛋白。采用考马斯亮蓝法和DNS显色法对成功表达的蛋白进行了蛋白浓度及酶活性检测，并对其性质进行了初步分析。对克隆获得的EsGH9-1蛋白质序列进行蛋白结构分析，对其无跨膜区的信号肽序列进行优化，得到表达的氨基酸序列，根据毕赤酵母偏爱密码子的使用原则，由优化得到的氨基酸序列反向推导出对应核苷酸序列，最终推导的核苷酸序列长度为1680bp，编码560个氨基酸。对推导的核苷酸序列进行人工合成，用于后续异源表达。最终获得分子量约为67kDa的异源分泌蛋白。对该异源蛋白进行酶活测定，发现其对羧甲基纤维素（CMC）底物具有一定的水解活性，说明该酶具有内切葡聚糖酶活力，但未检测到该蛋白对其余底物的水解反应活性。 本研究证实了中华绒螯蟹自身具有纤维素酶基因，并对其功能进行探究，为今后深入研究内源性纤维素酶在水生甲壳类的摄食与消化机制中的作用奠定了基础。
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