摘要
研究目的： 肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC，以下简称肝癌）是一种在所有肿瘤中发病率和致死率都处于“名列前茅”的恶性肿瘤，患者在早期症状尤为不明显且不易察觉，但后期病情发展较快，已严重威胁到人民的健康与生命。目前临床上有效治疗晚期肝癌的一线药物只有Sorafenib，但其引起的内质网应激会影响药物本身的疗效。内质网应激持续时间过长、强度过大会压倒性地超过细胞适应能力，其中应激压力持续存在情况下仅PERK-eIF2α-ATF4通路持续激活，随后通过ATF4激活CHOP促进细胞凋亡。在课题组前期的转录组测序结果中得知Sorafenib刺激肝癌细胞时会出现大量基因差异性表达，我们在其中筛选了一些上调显著的基因，其中就包含了持续内质网应激下存在的ATF4，这引起了我们的关注。为了进一步探讨ATF4是否会对肝癌细胞耐药产生影响，分析测序结果我们发现，Sorafenib刺激ATF4敲除后的肝癌细胞时部分基因表达变化趋势改变了。有趣的是，在Sorafenib刺激的ATF4敲除肝癌细胞中SH3BP2基因的上调趋势明显减弱了。越来越多的证据表明SH3BP2对巨颌症的发生起关键性的作用，也对胃肠道间质肿瘤增殖生长起着重要作用。然而，SH3BP2在肝癌细胞中的表达调控未知，且其作用研究较少。本文着力于探究内质网应激下ATF4对SH3BP2的表达调控，以及探讨SH3BP2是否影响肝癌细胞中的生长和迁移。 研究方法： 1．使用RT-PCR和Westernblot的方法检测Sorafenib和Tunicamycin处理下肝癌细胞中ATF4和SH3BP2的mRNA和蛋白质表达情况。 2．在Huh7细胞中使用RNA技术和CRISPR/Cas9基因敲除技术，筛选获得稳定敲减和敲除ATF4基因的肝癌细胞株。 3．通过共转染慢病毒载体和包装质粒，在293T细胞中制备慢病毒，然后慢病毒上清液感染Huh7和Hep3B细胞，最终筛选出稳定的SH3BP2基因敲减的细胞株。 4．通过克隆形成实验探究Sorafenib和Tunicamycin处理下SH3BP2基因缺失对肝癌细胞克隆形成的影响。 5．通过Transwellassay检测SH3BP2基因敲减对肝癌细胞侵袭能力的影响。 研究结果： 1.转录组测序结果表明Sorafenib能诱导肝癌细胞中ATF4和SH3BP2转录增加，使用RT-PCR和Westernblot方法分别证明无论是在mRNA水平还是蛋白水平Sorafenib、Tunicamycin均可上调ATF4和SH3BP2的表达，印证了测序结果。 2.Sorafenib、Tunicamycin时间梯度、浓度梯度处理肝癌细胞上调ATF4、SH3BP2的mRNA和蛋白表达水平，进一步确定在药物诱导的内质网应激下SH3BP2与ATF4上调趋势一致。 3.成功构建了稳定的ATF4基因敲减和ATF4基因敲除的Huh7细胞株。 4.Sorafenib、Tunicamycin诱导肝癌细胞内质网应激，在ATF4基因敲减/敲除肝癌细胞株中，SH3BP2mRNA和蛋白表达上调趋势明显减弱，提示肝癌细胞内质网应激时SH3BP2表达显著上调可能与ATF4有关。 5.成功构建了稳定的SH3BP2基因敲减的Huh7和Hep3B细胞株。 6.克隆形成结果表明敲低SH3BP2基因肝癌细胞生长的能力显著下降，在内质网应激状态下SH3BP2基因敲减细胞生长抑制更明显。 7.Transwell实验结果表明敲低SH3BP2基因肝癌细胞迁移能力显著下降，且在内质网应激状态下SH3BP2基因敲减肝癌细胞迁移能力抑制更明显。 结论： 索拉非尼、衣霉素处理肝癌细胞时产生内质网应激，诱导ATF4和SH3BP2mRNA和蛋白水平均表达上调。且在ATF4基因缺失肝癌细胞中SH3BP2mRNA和蛋白水平表达上调趋势明显减弱，表明肝癌细胞内质网应激时SH3BP2的表达受ATF4调控。此外克隆形成和细胞迁移实验表明SH3BP2基因敲减肝癌细胞的生长和迁移能力下降，且增强内质网应激对肝癌细胞生长和迁移的抑制效果，从而达到抑制肝癌细胞生长及侵袭迁移等恶性生物学行为的作用。
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