摘要
目的：钩吻素子(Koumine)是中国民间传统中药钩吻的主要活性成分，具有广泛的药理作用。近年来，国内外多项研究发现，钩吻素子在动物和细胞水平上对胃癌都有抑制作用，但其具体作用机制尚未明确。本研究结合了网络药理学的方法探索钩吻素子抗胃癌的作用机制，为今后钩吻素子抗胃癌的临床研究提供基础理论依据。 方法：通过搜索GeneCards数据库，获取胃癌相关的疾病靶点；利用Pharmmapper数据库、Swisstargetprediction数据库以及TargetNet数据库得到钩吻素子作用相关靶点。将疾病靶点和钩吻素子作用靶点进行维恩(Venn)分析，确定相交集靶点；借助STRING数据库构建蛋白相互作用(PPI)网络，并进行GO（基因功能）分析和KEGG（通路富集）分析；利用Cytoscape软件建立靶点—通路—疾病—成分的网络；获得钩吻素子抗胃癌的可能潜在作用靶点和作用通路，并通过分子对接和分子动力学模拟对钩吻素子抗胃癌的潜在靶点作用进行初步验证。通过CCK-8法体外观察钩吻素子对人胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用；AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测不同浓度钩吻素子对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响；利用WesternBlot蛋白印迹法检测钩吻素子对凋亡蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路上相关蛋白的表达影响。 结果： 1.通过Pharmmapper数据库、Swisstargetprediction数据库以及TargetNet数据库筛选获得176个钩吻素子蛋白靶点，利用GeneCards数据库检索得到5535个胃癌的相关蛋白靶点，两者交集后得到共同靶点106个。PPI网络构建发现MAPK1、HSP90AA1、GRB2、MAPK14、PTPN11、JAK2、PRKACA、LCK、JAK1以及HSP90AB1处于蛋白网络中的核心。GO分析的结果表明钩吻素子影响了小分子结合、细胞的刺激反应、生物正调控、细胞代谢过程等生物过程。KEGG通路分析发现主要的涉及的通路有癌症的途径、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路、Ras信号通路、Th17细胞分化、松弛素信号通路、T细胞受体信号通路、胰岛素抵抗、IL-17信号通路等。利用Cytoscape软件将106个交集靶点和KEGG分析得到的胃癌疾病相关通路作为节点构建靶点—通路—疾病—成分的网络，以自由度(Degree)值作为标准可得出较为重要的靶点及通路。关键靶点有MAPK1(ERK2)、GRB2、MAP2K1(MEK1)、GSK3B、MAPK14(p38)、MET、JAK2等。分子对接结果表明钩吻素子与MAPK1、MAP2K1、MAPK14等关键靶点具有亲和力。分子动力学模拟的结果表明钩吻素子能够与MAPK1形成稳定的复合物。网络药理学方法研究结果提示钩吻素子可能主要通过MAPK信号通路发挥抗胃癌作用。 2.体外胃癌细胞增殖CCK-8实验结果显示将不同浓度的钩吻素子(200、300、400、600、800μg/mL)作用于胃癌MGC-803细胞24h后，细胞活力随浓度的增加逐渐下降(300、400、600、800μg/mL给药组相比对照组P＜0.01)；AnnexinV-FITC/PI双染色法检测结果显示，相比于对照组，胃癌MGC-803细胞的凋亡率随钩吻素子浓度的增加逐渐递增(400、800μg/mL给药组相比对照组P＜0.01、200μg/mL实验组相比对照组P＜0.05)，其中早期凋亡率也随钩吻素子的浓度增加而升高(200、400、800μg/mL给药组相比对照组P＜0.01)；WesternBlot实验表明钩吻素子能够影响胃癌MGC-803细胞MAPK信号通路中p-ERK1/2与p-p38的表达水平,随着钩吻素子浓度的升高，p-ERK1/2表达下调，p-p38表达上调(400、800μg/mL给药组相比对照组P＜0.01、200μg/mL给药组相比对照组P＜0.05)。 结论：本研究采用网络药理学和分子对接的方法发现钩吻素子可以通过多靶点、多通路的调控发挥抗胃癌的作用。实验验证了钩吻素子对胃癌细胞的抑制作用，并发现MAPK通路是其发挥作用的一条重要的通路。本研究将为钩吻素子抗胃癌作用的临床研究及调控机制的进一步深入研究提供基础理论依据。
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