摘要
性别差异是有性生殖生物的基本特征，而性别决定及性别分化是生物个体发育过程中的主要过程。在水产动物中，两性的生长速度不同，因此理解和控制水产动物的性别发育意义重大。青蛤（Cyclinasinensis）是我国重要的养殖经济贝类之一，目前有关其性别决定及分化的研究较少。本研究以青蛤为实验对象，首先探究了不同月龄青蛤的生长规律，并通过组织学技术观察不同月龄的青蛤内脏团以探究其性别分化发生的最早时间；随后运用RNA-seq对成熟青蛤增殖期的精巢和卵巢进行转录组测序，通过高质量序列拼接组装及基因注释，深入挖掘与性别决定和分化、性腺发育等相关差异表达基因（DEGs）以及调控通路；最后通过对青蛤性别决定和分化相关基因dmrt1（double-sexandMab-3relatedtranscriptionfactor）和foxl2（forkheadtranscriptionfactorgene2）的序列进行生物信息学分析，并探究其在青蛤不同胚胎发育阶段、不同组织、不同性腺发育阶段及不同月龄幼贝中的表达差异以初步解析其基因功能。本研究有助于进一步了解青蛤性别决定和分化的分子机制，为后续青蛤遗传选育提供参考资料。具体结果如下： （1）青蛤幼贝生长及性腺组织学研究 青蛤幼贝首周年体重、壳重、软体重、壳长、壳高和壳宽六项生长指标增长同步，且呈阶段性增长，增长速率均呈先减小后增加的的趋势，在5-7月龄几乎停止生长。因此推测青蛤幼贝的生长呈季节性变化，且其生长受温度和饵料变化的影响。通过对青蛤3-12月龄去除斧足和肝胰腺的内脏团进行连续的组织学观察，发现在幼贝的内脏团中，三月龄时即可观察到精原细胞、精细胞等雄性特征，而在幼贝达到六月龄时才可观察到卵原细胞等雌性特征，这表明青蛤雄性性别分化时间早于雌性。 （2）青蛤雌雄性腺的转录组学分析 转录组结果显示总共获得rawreads条数为279,513,030（其中卵巢140,937,740，精巢138,575,290），经数据质控后，共获得cleanreads条数为277,871,788（其中卵巢140,109,554，精巢137,762,234），Q30碱基百分比在93.1%以上。使用DESeq2软件，共获得1,440条精巢与卵巢的差异表达基因。对DEGs进行GO和KEGG富集分析，发现DEGs显著富集的term包括细胞周期过程（cellcycleprocess）、生殖过程（reproductiveprocess）、精子发生（spermatogenesis）等，主要富集的通路有细胞循环（Cellcyclepathway，map04110）、cAMP信号通路（cAMPsignalingpathway，map04024）、FoxO信号通路（FoxOsignalingpathway，map04068）等。而cAMP信号通路对于生物的性别决定的调控中具有重要作用。通过筛选获得了dmrt1、hpgds、ctsd、smad4、sox30、cdk2、foxl2和gata4基因跟性别决定和分化相关的DEGs以及ccnb3、cdc20和vn跟性腺发育相关的DEGs。 （3）青蛤性别相关基因dmrt1和foxl2基因的表达分析 采用RACE技术克隆青蛤dmrt1和foxl2基因的cDNA全长。Csdmrt1的cDNA全长为1,611bp，开放阅读框序列1,137bp，共编码378个氨基酸；Csfoxl2的ORF区为1,245bp，amp;nbsp;编码414个氨基酸，存在保守的FH结构域。分析Csdmrt1和Csfoxl2的时空表达，发现Csdmrt1的表达呈现性别二态性，在精巢内显著高表达，推测该基因参与雄性青蛤的性别决定和分化；两个基因在性腺不同发育时期的表达水平与性腺发育呈正相关，可见Csdmrt1与Csfoxl2基因在青蛤性腺的发育与维持中发挥重要作用，且可能参与生殖细胞的形成；在所有组织中，Csfoxl2基因在斧足的表达量最高，推测Csfoxl2在青蛤神经干细胞的发育及组织的分化和形成中发挥着重要的作用；分析青蛤不同月龄内脏团的Log10(dmrt1/foxl2)值的动态变化，发现dmrt1基因在3-5月龄相对于foxl2表达量较高，从6月龄起，foxl2相对于dmrt1开始高表达，与第二章中获得的雌雄青蛤生理上性别分化的时间点相吻合，推测dmrt1和foxl2的相对表达变化能够导致青蛤分化为不同性别。
NETL