摘要
韭菜营养丰富，是消费者普遍喜食的蔬菜，在我国有大面积种植。韭菜生产过程中易发茎枯病、灰霉病、韭蛆等病虫害，防治用农药种类多，农药多残留超标和超范围使用问题突出，引起广泛关注，也成为国家近年来重点治理的蔬菜品种。快速检测是第一时间发现问题的有力抓手，基于抗原抗体特异性结合的胶体金免疫层析技术因时效性强、灵敏度高、方便低成本已成为污染物快速检测的主流技术，被用于农产品/食品安全的现场快速筛查。然而，由于化学性农药分子量小，抗体制备难，导致覆盖种类少，加之样品基质干扰和多残留检测的瓶颈，现有的技术方法急需创新以满足果蔬农药多残留同步现场快速检测需求。 论文以韭菜中腐霉利、啶虫脒、吡虫啉、克百威、嘧霉胺和多菌灵等6种农药作为研究对象，在设计、合成、制备半抗原和抗体的基础上，研究韭菜基质中叶绿素和有机硫化物对胶体金免疫层析的基质效应，并深入研究其影响机理。通过优化前处理方法降低或消除基质效应，并采用多重T线策略研制胶体金试纸条，结合课题组自主研发的免疫层析图像识别系统，构建准确性好、灵敏度高、智能化的农药多残留快速检测技术方法。为实现高通量、智能化检测韭菜中农药多残留提供理论基础和方法参考，切实保障韭菜质量安全。主要研究内容如下： 1、本研究选择1,2-二甲基环丙烷-1,2-二羰基亚胺作为腐霉利半抗原的特征结构，含羧基的碳链取代氯原子，合成腐霉利半抗原。采用活泼酯法，将腐霉利半抗原分别与BSA和OVA偶联。腐霉利半抗原-BSA作为免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合和有限梯度稀释法成功制备特异性强的腐霉利单克隆抗体6E4D9，ELISA灵敏度IC50为86.57ng/mL，检出限IC20为14.42ng/mL。腐霉利与其结构类似物交叉反应率小于1%，具有良好的特异性。性能优异的腐霉利单克隆抗体为进一步构建胶体金免疫层析方法提供了核心材料，可满足腐霉利最大残留限量检测需求。 2、本研究在构建同源包被胶体金免疫层析方法的基础上，通过改变T线上的包被原，使腐霉利胶体金免疫层析法的灵敏度提高了10倍。进一步研究了韭菜中叶绿素和有机硫化物对胶体金免疫层析法检测腐霉利、啶虫脒、吡虫啉、克百威、嘧霉胺和多菌灵等农药残留的基质效应和影响机理。结果表明：叶绿素和有机硫化物对检测结果均有影响，且叶绿素是主要干扰因素。叶绿素通过影响抗原抗体亲合力，进而影响胶体金免疫层析检测结果的准确性。通过分子对接和分子动力学模拟，探明了叶绿素主要通过影响库伦相互作用，使腐霉利抗原抗体结合更稳定、亲合力更强，其中腐霉利抗体中的43LYS、107TRP和141ARG是起稳定作用的关键氨基酸。从机理上研究叶绿素对抗原抗体亲合力的影响，为最大限度降低胶体金免疫层析基质效应提供理论基础。 3、本研究通过优化样品前处理步骤，基质稀释3000倍减少特异性结合，加入甲酸使叶绿素降解，最大限度地降低了基质效应，并采用多重T线策略研制胶体金试纸条，结合课题组自主研发的免疫层析图像识别系统和制备的其它抗体，构建可同时半定量检测嘧霉胺、啶虫脒、克百威、3-OH克百威、腐霉利和多菌灵6种农药的智能化胶体金免疫层析方法。该多重T线胶体金免疫层析法对3-OH克百威的交叉反应率达到73%，可满足GB2763-2021《食品中农药最大残留限量》中对于克百威残留定义的规定。该方法检测韭菜基质中嘧霉胺、啶虫脒、克百威、3-OH克百威、腐霉利和多菌灵的检出限分别为18.96、18.72、12.63、15.48、115.32和9.42μg/kg，平均回收率为71%-92%，RSD为5%-18%，与LC-MS/MS检测结果具有良好一致性。表明该方法具有良好的灵敏度、准确度、精密度和特异性，可实现韭菜中农药多残留的准确、高通量、智能化快速检测。
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