摘要
番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一种细菌性维管束病害。青枯菌宿主范围广泛，可以影响450多种植物的生长，造成严重的经济损失。青枯病在我国危害严重，呈现由北向南，由西向东发病逐渐提前，程度逐渐加重的趋势。生物防治因其绿色、安全、不易产生抗药性等优点，受到国内外研究人员的关注。本研究以番茄青枯病为研究对象，采用活体盆栽的方式筛选到一株高效拮抗菌株YS05，对其进行系统鉴定和生物学特性分析，优化了摇瓶发酵工艺，同时利用比较基因组分析挖掘菌株YS05的生防潜力。主要研究内容如下： 1.建立了番茄青枯病拮抗菌株活体盆栽筛选体系，筛选获得了一株高效拮抗菌株YS05，对番茄青枯病盆栽防效为78.01%。测定不同的青枯病原菌的接种方式、接种浓度和环境温度等对番茄青枯病致病力的影响，确定番茄青枯病盆栽发病条件为：病原菌以浓度为106CFU/g拌土处理，环境温度30℃，16h光照和8h黑暗交替。采用番茄青枯活体盆栽和离体平板对峙试验，从课题组前期获得到的23株假单胞菌中筛选获得一株拮抗绿针假单胞菌YS05，对番茄青枯病防效可达78.01%。此外，本研究中还选择一株对病原真菌防效较好，但对番茄青枯病防效较差的绿针假单胞菌YS21作为对照菌株。 2.明确了绿针假单胞菌YS05和YS21的分类地位，探明了两株菌在抗生素耐受、酶活和次生代谢物等生防相关指标的异同。结合菌株形态学观察、生理生化特性、多基因系统发育树和ANI-DDH结果，鉴定菌株YS05和YS21均属于绿针假单胞菌桔黄亚种P.chlororaphissubsp.aurantiaca。比较分析了两株菌的生物学特性，测定了两株菌对10种常见抗生素的耐受水平，蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和磷酸酯酶等酶活水平，以及次生代谢物如氢氰酸和吩嗪及其衍生物的合成能力。通过平板抑菌试验和顶空固相微萃取（SPME）结合气质联用色谱（GC-MS）对抑菌物质进行了鉴定和比较分析，确定其主要抑菌物质为烃类化合物如醇类和酮类，差异次生代谢物为2-壬醇（2-Nonanol）、2-壬酮（2-Nonanone）环十二酮（Cyclododecanone）和2-壬酮-1-醇（2-Nonen-1-ol）。此外本研究还比较分析了两株细菌固体表面运动、游动、泳动和植物根际定殖能力，菌株YS21运动和定殖能力均高于菌株YS05。 3.完成了绿针假单胞菌桔黄亚种YS05和YS21全基因组测序和比较基因组分析，初步揭示了两株菌在次生代谢物、细胞分泌系统和双组分信号转导系统等功能基因的差异。为系统解析并揭示菌株YS05、YS21的遗传信息及功能基因，本研究采用Pacbio测序平台完成菌株YS05和YS21的全基因组序列测序，并选择4株具有代表性的生防假单胞菌，发现菌株YS05具有区别于其他绿针假单胞菌的acyldepsipeptide1和furan等相关次生代谢物合成基因簇。此外不同于菌株YS21，菌株YS05含有编码细胞TypeⅢ分泌系统和部分双组分信号转导系统功能基因。 4.优化了绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的摇瓶发酵工艺，显著提高菌株YS05发酵液对番茄青枯病和番茄灰叶斑病的防治效果。本研究结合发酵液菌体数量为参考指标，采用单因素试验、正交试验、最陡爬坡试验等对菌株YS05摇瓶发酵工艺进行优化。确定最适发酵培养基组分为葡萄糖17.5g、胰蛋白胨7.5g，K2HPO41.5g，蒸馏水1000mL；最适发酵条件为pH值为7、温度为28℃、接种量为1%（v/v）、转速为220r/min、装液量为20/250mL时，菌落数和吸光度OD600值达到最大，分别为8.35×108CFU/mL和2.47。此外优化前后发酵液对番茄青枯病和番茄灰叶斑病的防治效果分别提高了17.06%和11.11%，且高于地衣芽孢杆菌等5种药剂。 本研究筛选出对番茄青枯病具有高效拮抗效果的菌株YS05，明确了其分类地位和主要的抑菌物质，优化了其发酵工艺，并通过比较基因组分析预测了相关的功能基因，为菌株YS05的生防制剂开发应用和生防机理的研究提供了技术支持和理论依据。
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