摘要
溶瘤病毒疗法是利用溶瘤病毒选择性感染并杀伤肿瘤细胞进而激发全身性抗肿瘤免疫应答的肿瘤免疫治疗方法。免疫调节基因重组入溶瘤病毒可进一步增强其抗肿瘤效能。4-1BBL属于共刺激分子TNF超家族成员，在抗肿瘤免疫过程中发挥重要作用。本研究通过建立4-1BBL基因转染肠癌细胞及小鼠荷瘤模型验证了 4-1BBL的抗肿瘤作用;进而利用课题组前期构建的4-1BBL重组溶瘤病毒探讨了其抗肿瘤效应及机制;在此基础上，联合应用4-1BBL重组溶瘤病毒和PD-1单抗进一步提升抗肿瘤效能。本研究为基于溶瘤病毒的肿瘤免疫治疗提供了新的实验依据。 第一部分 4-1BBL基因表达对于小鼠肠癌细胞体内外生长的影响 目的:通过体内外实验验证4-1BBL的抗肿瘤作用。 方法:通过分子克隆的方式构建重组质粒pLVX/4-1BBL,并将该质粒和辅助病毒载体共转染293T细胞，用所得的病毒上清感染MC-38细胞。经嘌呤霉素加压筛选后，获得4-1BBL基因转染肠癌细胞株。采用RT-PCR和流式细胞术检测基因转染肠癌细胞中4-1BBL的表达。采用细胞计数法检测4-1BBL基因表达对于肠癌细胞体外生长的影响。采用小鼠皮下瘤模型和腹腔荷瘤模型，观察比较肠癌细胞的体内生长和小鼠的生存情况。 结果:1.RT-PCR检测表明，4-1BBL基因转染MC-38细胞(命名为MC-38/4-1BBL)表达4-1BBL基因;流式细胞术检测表明，4-1BBL分子表达于MC-38/4-1BBL细胞表面。 2.细胞计数结果表明:与对照组细胞MC-38/Ctrl相较，MC-38/4-1BBL细胞的体外生长速度无明显差异(P=0.9607＞0.05)。 3.小鼠皮下荷瘤模型实验结果显示:与MC-38/Ctrl组相较，MC-38/4-1BBL组肿瘤生长速度明显减慢(P=0.0007＜0.001);小鼠腹腔瘤模型实验结果显示:与MC-38/Ctrl组相比，MC-38/4-1BBL组荷瘤小鼠生存期明显延长(P=0.0013＜0.01)。 结论:4-1BBL表达于肿瘤细胞表面并不影响其体外生长，但可以抑制肿瘤的体内生长速度并延长小鼠的生存期，这提示了 4-1BBL可通过激发体内抗肿瘤效应降低机体肿瘤负荷。 第二部分 4-1BBL重组溶瘤病毒的抗肿瘤效应及作用机制研究 目的:观察4-1BBL重组溶瘤病毒(VV-△TK-4-1BBL)的抗肿瘤作用并探讨其作用机制。 方法:将VV-△TK-4-1BBL感染MC-38细胞后，通过RT-PCR和流式细胞术检测4-1BBL的表达。通过病毒滴度法和MTT法分别检测VV-△TK-4-1BBL在肿瘤细胞内的增殖能力以及对肿瘤细胞的杀伤能力。使用VV-△TK-4-1BBL治疗小鼠MC-38腹腔荷瘤模型，观察小鼠的生存情况。采用VV-△TK-4-1BBL治疗荷瘤小鼠，5天后分别取出脾脏和肿瘤组织，通过流式细胞术检测T细胞等免疫细胞及其表达PD-1等免疫分子的情况，通过 Real-time PCR 分析 IFN-γ、TNF-α、Perforin、Granzyme B、IL-1β、IL-10、TGF-β的表达量。而后将 VV-△TK-4-1BBL 与 PD-1阻断抗体联合干预MC-38小鼠模型，观察小鼠的生存情况。 结果:1.RT-PCR结果显示VV-△TK-4-1BBL感染MC-38细胞后，可在mRNA水平上检测到4-1BBL表达的增高;流式细胞术结果表明，VV-△TK-4-1BBL感染MC-38细胞后，4-1BBL的表达于MC-38细胞表面。 2.病毒滴度实验结果显示:与对照病毒(VV-△TK)相比，VV-△TK-4-1BBL在不同肿瘤细胞内的增殖能力无明显差异;MTT实验结果显示:与VV-△TK相比，VV-△TK-4-1BBL对不同肿瘤细胞的溶瘤能力没有统计学差异。 3.小鼠肠癌模型的生存结果显示:与PBS治疗组相比，VV-△TK治疗组生存期明显延长(P=0.0208＜0.05);而 VV-△TK-4-1BBL治疗组小鼠生存期明显优于 VV-△TK 治疗组(P=0.0212＜0.05)和 PBS 治疗组(P=0.0004＜0.001)。 4.脾脏称重和脾细胞计数结果表明:VV-△TK-4-1BBL治疗组脾脏质量和脾细胞数量明显高于VV-△TK治疗组和PBS治疗组。与VV-△TK治疗组和PBS治疗组相比，VV-△TK-4-1BBL治疗组CD3+T细胞的比例无明显统计学差异;CD8+T细胞的比例显著增高，而CD4+T细胞的比例明显下降;CD4+T和CD8+T细胞表面PD-1明显上调表达。 5.肿瘤组织的分析结果显示:PBS组和VV-△TK组肿瘤质量无明显差异，但明显大于 VV-△TK-4-1BBL治疗组。与VV-△TK和PBS治疗组相比，VV-△TK-4-1BBL治疗组的CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞比例明显增高。Real-time PCR结果显示:VV-△TK-4-1BBL 治疗组 IFN-γ、Perforin、Granzyme B、IL-1β、IL-10 表达量明显高于VV-△TK和PBS治疗组;VV-△TK-4-1BBL和 VV-△TK治疗组TNF-α的表达量没有统计学差异，但均高于PBS治疗组;VV-△TK治疗组TGF-β的表达量明显高于PBS治疗组和VV-△TK-4-1BBL治疗组。 6.VV-△TK-4-1BBL与PD-1抑制剂单一使用均可增加MC-38荷瘤小鼠的生存时间;两者联合应用可进一步提高小鼠的生存率。 结论:VV-△TK-4-1BBL感染可以实现4-1BBL在肿瘤细胞的表面表达，在肿瘤微环境中激发有效的抗肿瘤免疫效应，延长了荷瘤小鼠的生存期。PD-1阻断性单抗可进一步增强VV-△TK-4-1BBL的抗肿瘤效应，这为重组溶瘤病毒联合PD-1阻断治疗肿瘤提供了实验依据。
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