摘要
低温霜冻是影响马铃薯生产的主要自然灾害之一，不仅造成马铃薯植株损伤，严重的可导致减产甚至绝收。目前马铃薯栽培品种主要为普通栽培种（S.tuberosum)，抗寒性较差，且无明显的冷驯化能力，但马铃薯野生种中具有较多抗寒资源，其中包括S.commersonii（二倍体）、S.acaule（四倍体）、S.demissum（六倍体）等，通过将野生资源的抗寒基因导入栽培品种的遗传改良是减轻低温霜冻危害的一种较为有效的手段。本研究对包括W3（S.commersonii）在内的253份野生种材料进行了耐寒性鉴定，并通过转录组分析挖掘了W3耐寒调控网络中的关键代谢通路和耐寒相关基因，利用qRT-PCR进一步比较了肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS1、GolS2和GolS3基因在W3和底西芮B7（S.tuberosum)中的表达模式，并对W3中ScGolS1进行了克隆及功能验证，初步解析了肌醇半乳糖苷合成酶调控马铃薯耐寒的分子机理。主要研究结果如下： 1.鉴定评价并获得了一批耐寒野生种材料。通过对包括S.commersonii和S.acaule等在内253份野生种材料进行田间自然霜冻鉴定，结果显示有W3、03079-430、03079-440等24份材料属于强耐寒性材料；有03106-594、03112-249、03088-347等85份材料属于霜冻敏感材料；进一步对W3冷驯化前后的生理生化指标进行测定，结果表明丙二醛（MDA）含量变化不显著，脯氨酸（Pro）、可溶性糖及可溶性蛋白含量均显著升高，进一步确定了W3的耐寒性。 2.建立了W3耐寒相关基因表达谱，挖掘了20个耐寒相关候选基因。转录组分析发现W3经不同低温处理下共有8088个基因差异表达，其中冷处理特有的差异表达基因（DEGs）有4124个；对冷处理特有的DEGs进行GO和KEGG富集分析，发现大量转录因子及半乳糖、精氨酸和脯氨酸等代谢相关的基因显著差异表达。进一步分析发现，W3在冷驯化期间蛋白酶体相关基因全部上调表达，光合相关基因大部分下调表达，并筛选了20个耐寒关键候选基因，其中包括棉子糖系列寡糖代谢途径中GolS基因、乙烯代谢通路中的ERF转录因子以及脯氨酸代谢途径中的的P5CR基因等。 3.GolS基因响应冷胁迫诱导表达，参与抵御冷逆境。利用W3的组培苗和盆栽苗对GolS基因进行了表达分析，发现GolS1基因在组培苗和盆栽苗的叶中表达水平高于根和茎，且嫩叶高于老叶；GolS2基因在组培苗的茎中表达水平高于根和叶，在盆栽苗中幼叶＞茎＞老叶＞根；GolS3在组培苗中叶＞根＞茎，在盆栽苗中幼叶＞茎＞老叶＞根；综上，说明在进行耐寒表型鉴定时选择盆栽苗的幼叶鉴定结果较为可靠。马铃薯野生种W3的GolS1、GolS2以及GolS3基因在不同低温处理下，随着温度的降低，呈现上调表达，但在B7中不表达或表达量低，无明显规律；在同一低温持续处理下，GolS1、GolS2和GolS3基因在B7中仍不表达或表达量低，无明显规律，但在W3中GolS2和GolS3均上调表达，并在处理12h时相对表达量急剧上升至峰值，而GolS1基因则在处理48h时达到峰值，预示着W3中GolS1、GolS2和GolS3基因通过上调表达响应冷冻胁迫，抵御逆境。 4.克隆并功能验证了ScGolS1基因。从二倍体马铃薯野生种W3中克隆得到GolS1基因的cDNA全长，并命名为ScGolS1；其开放阅读框（ORF）长度为969bp，编码322个氨基酸，推导出的氨基酸序列与其他茄科植物的GolS具有高度的一致性。利用农杆菌介导的基因转化将ScGolS1基因分别导入寒敏感品种“底西芮”（B7）和“大西洋”（B44）中，分别获得了13和39株过表达阳性转基因植株。对转ScGolS1基因的过表达株系进行T-DNA插入位点分析，发现ScGolS1基因在受体马铃薯基因组中的整合位置和拷贝数均有差异；耐寒性表型鉴定结果表明，ScGolS1基因的过表达显著增强了转基因马铃薯的耐寒性，且耐寒性与ScGolS1基因在转基因植株中的插入位点和拷贝数相关，拷贝数高的耐寒性强；进一步的生理生化分析发现转基因植株的相对电导率和丙二醛含量均较低、DAB染色变浅、冷冻后存活率高。
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