摘要
研究背景： 食管癌是消化系统常见之肿瘤，每年全球约有30万人因食管癌死亡，我国亦是食管癌高发之地区。食管癌发病复杂，与以下多方面都有关联，包括年龄、职业、种族、性别、饮食生活习惯等。异粘蛋白(metadherin,MTDH)别名AEG-1、LYRIC或3D3，其遗传基因位于人类8号染色体(8q22)，内含11个内含子以及12个外显子，其编码基因是新近发现的一个癌基因。近年来的研究证实了MTDH在肿瘤进展的几个关键方面的作用，包括转化、逃避凋亡、侵袭、转移、化疗耐药和自噬。细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的过程，自噬异常可导致癌细胞的出现。目前已经有文献报道了在食管癌细胞中MTDH呈高表达，然而MTDH如何介导自噬进而影响食管癌发病风险的机制研究较少，值得进一步研究。本研究拟采用分子和细胞生物学方法深入探讨MTDH影响自噬调控进而影响食管癌发生发展的分子机制。 研究目的： 1.筛选并验证与食管癌发病风险显著相关的分子MTDH。 2.探讨MTDH参与食管癌发病的分子机制。 3.确定食管癌遗传易感性相关的分子标志物，以期为食管癌的高危人群筛查提供更多的理论参考。 研究方法和结果： 1.公共数据库TCGA以及MTDH稳定敲减的食管癌细胞株转录组数据分析 （1）应用在线网站GEPIA对TCGA公共数据库进行分析，将其中的182例食管癌患者和286例正常人群的食管组织对比，分析其中MTDH的表达情况。其结果表明，与正常组织比较，MTDH在食管癌中显著上调。 （2）构建MTDH稳定敲减的食管癌细胞株并进行转录组测序分析，测序结果显示MTDH在Eca-109细胞中被成功敲低，可用于后续分析。为了进一步探索MTDH对食管癌的影响，我们通过DAVID网站对差异表达基因进行了功能富集分析，KEGG结果显示有4个基因MTDH，ZC3H12A，TP53INP2和TRIM65显著富集到自噬通路，且MTDH，SIRT1，ZC3H12A显著富集到血管生成通路，提示MTDH可能通过SIRT1介导食管癌细胞的自噬调节，进而影响肿瘤的发生发展。 2.MTDH影响食管癌发生发展的机制研究 （1）采用CCK-8法和Transwell小室法检测细胞活性，发现敲低MTDH可以显著抑制食管癌细胞的增殖速度和迁移能力。 （2）研究显示，Beclin1和LC3在自噬调控研究中可以作为一个独特的自噬指标被使用。通过Western blot实验观察不同的MOI梯度（MOI=2.5, 5, 10）处理食管癌细胞中自噬相关蛋白的表达情况。实验结果显示，在MTDH被稳定敲低的Eca-109和TE-1两种食管癌细胞中，自噬相关蛋白标志物Beclin-1和LC3B表达上调，而自噬抑制剂3-MA可拮抗MTDH敲低对食管癌细胞自噬的增强作用。 3.MTDH调节食管癌自噬水平进而影响恶性表型的机制探索 （1）首先通过文献检索和测序手段寻找到MTDH的下游靶标SIRT1，最终通过qRT-PCR在两种食管癌细胞中进行验证。结果表明，SIRT 1或可作为一种由MTDH稳定调控的靶标，影响到食管癌细胞的自噬调节过程。 （2）为了进一步探索SIRT1在食管癌发生发展中的作用，我们依次过表达或敲低SIRT1，使用CCK-8法和Transwell小室法进行检测，观察SIRT1对Eca-109和TE-1细胞株增殖和迁移之影响。结果显示SIRT1上调可显著促进食管癌细胞的增殖和迁移。 （3）通过WB实验探索SIRT1稳定上调的细胞和SIRT1稳定敲低细胞对食管癌自噬过程的影响，结果表明SIRT1与食管癌细胞中LC3B蛋白以及Beclin1蛋白表达显著相关，提示SIRT1具有抑制食管癌细胞自噬功能。 结论： 本研究发现MTDH在食管癌中高表达，充当癌基因角色。进一步敲减食管癌细胞中MTDH的编码基因，发现MTDH低表达后，食管癌细胞的增殖和迁移等情况均被抑制，且认为这种抑制作用是由于食管癌细胞自噬过程增加介导的，自噬抑制剂3-MA可拮抗MTDH敲低对食管癌细胞自噬的增强作用。MTDH通过影响SIRT1参与调节食管癌自噬过程，可抑制其自噬调节。研究结果为寻找食管癌遗传易感性的分子标志，揭示食管癌的可能发病机制提供了部分理论依据。
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