摘要
目的： 研究固有免疫预刺激对慢性应激所致小鼠焦虑样行为的预防作用和可能机制。 方法：以成年雄性小鼠（C57BL6/J品系）为研究对象，用经典的慢性社会挫败应激（chronic social defeat stress, CSDS）诱导小鼠产生焦虑样行为；采用固有免疫细胞经典抑制剂米诺环素研究固有免疫激活在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）预处理抑制CSDS所致小鼠焦虑样行为中的作用；用高架十字迷宫（elevated pluz maze, EPM）实验、明暗箱实验（light-dark test, LDT）、旷场实验（open field test, OFT）等方法评价小鼠焦虑样行为变化；用实时定量 PCR 技术和酶联免疫吸附测定（ enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒检测小鼠海马和前额皮层白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等促炎因子mRNA或蛋白表达变化；用ELISA试剂盒检测各组小鼠海马和前额皮层脑源性生长因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）含量变化；用脑立体定位技术在小鼠侧脑室给予抗BDNF抗体；用腹腔注射酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor B, TrkB）受体阻断剂K252a的方法阻断大脑BDNF信号；构建BDNF缬氨酸位点→甲硫氨酸位点(68)功能突变(BDNF Val→Met (68))转基因C57BL/6J小鼠阐明BDNF在LPS预处理预防性抑制CSDS所致小鼠焦虑样行为中的作用。 结果：（一）单次低剂量LPS预处理以时间和剂量依赖方式预防性抑制CSDS所致小鼠焦虑样行为。鉴于固有免疫激活具有剂量效应，即随着免疫激活剂的剂量增加，免疫增强效应也随之增加，我们首先研究了不同剂量LPS预处理及LPS预处理与社会挫败应激暴露之间不同时间间隔对慢性应激所致小鼠焦虑样行为的影响。剂量依赖结果显示：在EPM、LDT、OFT实验中，于社会挫败应激暴露前1天给予单次不同剂量LPS注射（50、100、500μg/kg）能够预防性抑制由CSDS引起的小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数减少、小鼠明箱逗留时间缩短及小鼠旷场中心区域逗留时间缩短；上述效应在LPS剂量为50μg/kg情况下表现出显著的统计学意义，且在LPS剂量为100μg/kg时达到最佳效应。时间依赖结果显示：在社会挫败应激暴露前1天或5天腹腔注射单次低剂量LPS（100μg/kg）能预防性抑制由CSDS引起的小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数减少、小鼠明箱逗留时间缩短及小鼠旷场中心区域逗留时间缩短，但如果将LPS注射和社会挫败应激之间的时间间隔延长为10天，那么由单次低剂LPS注射引起的焦虑预防效应将不再能够被观察到，提示由LPS预处理产生的焦虑预防效应具有时间窗效应。 （二）单次低剂量LPS焦虑预防作用消失后再次给予同等剂量LPS对CSDS所致小鼠焦虑样行为的影响。鉴于社会挫败应激暴露前10天单次低剂量LPS注射（100μg/kg）不能预防性抑制由CSDS诱导的小鼠焦虑样行为，且由LPS诱导产生的焦虑预防作用具有时间依赖效应，我们尝试研究了能应对基于上述特点的、焦虑预防效应消失的潜在方案。我们首先采取一种所谓的二次注射方案，即在先前由单次LPS注射产生的焦虑预防作用消失后，观察第二次低剂量LPS注射是否还能产生同样的焦虑预防效应。实验结果显示，在低剂量（100μg/kg）LPS首次注射10天后，再次给予小鼠低剂量（100μg/kg）LPS注射仍然能够预防性抑制由CSDS引起的小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数减少、小鼠明箱逗留时间缩短及小鼠旷场中心区域逗留时间缩短，这表明在前次预防效应消失后，再次注射同等剂量LPS仍然能使小鼠获得预防焦虑产生的应激抵抗能力。 （三）应激暴露前重复增强免疫对CSDS所致小鼠焦虑样行为的影响。为进一步研究能应对基于上述特点的、焦虑预防效应消失的潜在方案，我们探讨另一个问题，即在社会挫败应激暴露前10天给予连续4次LPS注射（4×）是否能够预防性抑制由CSDS引起的小鼠焦虑样行为。实验结果显示，在社会挫败应激暴露前10天给予1× LPS不能预防焦虑样行为的产生，但在社会挫败应激暴露前10天给予4× LPS注射则能显著抑制由CSDS引起的小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数减少、小鼠明箱逗留时间缩短及小鼠旷场中心区域逗留时间缩短，这表明在社会挫败应激暴露前增强固有免疫激活能够通过延长固有免疫激活剂保护小鼠免于发展出焦虑样行为时间窗的方式预防焦虑发生。 （四）单次低剂量LPS预处理预防性抑制由CSDS引起的小鼠神经炎症反应。神经炎症与慢性应激所致焦虑形成之间的关系非常密切，我们的实验结果显示，社会挫败应激暴露前1天给予小鼠单次低剂量LPS注射（100μg/kg）能够显著抑制由CSDS引起的小鼠海马和前额皮层IL-1β、IL-6和 TNF-α等促炎因子水平增加，这表明LPS预处理能够同时抑制由慢性应激引起的小鼠焦虑样行为和神经炎症反应的产生。 （五）固有免疫激活介导LPS对CSDS所致小鼠焦虑样行为和神经炎症反应的预防性抑制作用。鉴于LPS是经典的固有免疫激活剂，我们随后用米诺环素研究了固有免疫系统激活在LPS预处理发挥焦虑预防效应中的作用。实验结果显示，在单次低剂量LPS（100μg/kg）注射前给予小鼠米诺环素（40 mg/kg）预处理，能够取消由社会挫败应激暴露前单次LPS注射引起的CSDS小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数增加、小鼠明箱逗留时间延长及小鼠旷场中心区域逗留时间延长；随后我们研究了固有免疫系统激活是否介导LPS预处理对CSDS所致小鼠神经炎症反应的预防性抑制作用。实验结果显示，单次低剂量LPS注射（100μg/kg）前给予小鼠米诺环素预处理能够取消由LPS引起的CSDS小鼠海马和前额皮层IL-1β、IL-6和 TNF-α水平减少。以上结果表明，LPS对CSDS所致小鼠焦虑样行为和神经炎症的预防性抑制作用需要固有免疫系统的激活。 （六）BDNF信号在LPS预处理抑制CSDS所致小鼠焦虑样行为中的作用。除神经炎症反应外，CSDS还能通过其它机制促进焦虑样行为的产生，BDNF信号功能受损就是其中一种。为此，我们探索了BDNF信号在LPS预处理抑制CSDS所致小鼠焦虑样行为中的作用。实验结果显示，社会挫败应激暴露前的单次低剂量LPS注射（100μg/kg）能够显著抑制由CSDS引起的小鼠海马和前额皮层BDNF蛋白减少；用抗BDNF抗体中和BDNF蛋白，能够取消由社会挫败应激暴露前单次LPS注射引起的CSDS小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数增加、小鼠明箱逗留时间延长及小鼠旷场中心区域逗留时间延长；同时，BDNF Val→Met (68)突变也能取消由社会挫败应激暴露前单次LPS注射引起的CSDS小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数增加、小鼠明箱逗留时间延长及小鼠旷场中心区域逗留时间延长；进一步的研究发现，用K252a阻断BDNF受体信号功能，能够取消由社会挫败应激暴露前单次LPS注射引起的CSDS小鼠开臂逗留时间和开臂进入次数增加、小鼠明箱逗留时间延长及小鼠旷场中心区域逗留时间延长。以上结果表明，BDNF及其下游信号功能的完整对LPS预处理发挥焦虑预防作用至关重要。 （七）固有免疫激活介导LPS对CSDS所致小鼠BDNF表达减少的预防性抑制作用。鉴于慢性应激情况下，神经炎症通常与脑内BDNF信号功能受损密切相关，我们猜测由LPS预处理引起的CSDS小鼠神经炎症反应减弱是否与脑内BDNF信号增强存在因果关系。实验结果显示，单次低剂量LPS注射（100μg/kg）前给予小鼠米诺环素预处理能取消由LPS引起的CSDS小鼠海马和前额皮层BDNF增加，这一方面表明LPS对CSDS所致小鼠脑内BDNF减少的预防性抑制作用需要固有免疫系统的激活，另一方面也间接证明了由LPS预处理引起的CSDS小鼠脑内BDNF信号增强可能是由LPS预处理引起的CSDS小鼠脑内神经炎症反应减弱介导的。 结论：(1) 单次低剂量LPS预处理刺激能以时间和剂量依赖方式预防性抑制由CSDS引起的小鼠焦虑样行为和神经炎症反应，且上述作用是由固有免疫系统激活介导的；(2) 将社会挫败应激暴露和LPS预处理之间的时间间隔延长至10天能够取消由LPS预处理引起的焦虑预防效应；(3) 在首次低剂量LPS注射10天后再次给予第二次低剂量LPS注射，或在社会挫败应激应激暴露前一天给予小鼠连续4次低剂量LPS注射，仍然能使小鼠获得抵抗焦虑行为出现的应激抵抗能力；(4) 脑内BDNF信号介导LPS预处理对CSDS所致小鼠焦虑样行为中的预防作用；(5) 固有免疫激活介导LPS对CSDS所致小鼠BDNF表达减少的预防性抑制作用。
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