摘要
背景和目的： 食管癌是全球高发病率及死亡率的消化系统恶性肿瘤之一。根据组织病理类型，食管癌由食管鳞状细胞癌和食管腺癌两种主要的亚型组成，食管鳞状细胞癌主要发生在东亚地区，而食管腺癌则发生在西方国家。手术、放疗、化疗、分子靶向治疗及其组合是当前食管癌治疗的主要策略，然而因食管癌起病隐匿，发现时多处于中晚期，且侵袭性高，食管癌的预后仍然比较差，总体五年存活率仅有20%。因此，迫切需要寻找更多的食管癌生物标志物和治疗靶点。 环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）是花生四烯酸代谢的限速酶和前列腺素E2（PEG2）类前列腺素生物合成的催化剂，在促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、抑制肿瘤免疫、促进侵袭和转移等细胞恶性行为中起着关键的作用。越来越多的证据表明COX-2是炎症和癌症之间的纽带，并被认为是癌症治疗的主要靶点。COX-2还与多种肿瘤的不良的预后有关，特别在结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌和肺癌的淋巴结转移。但是COX-2在食管鳞癌恶性转化过程中的作用及机制尚不明确。因此，本课题拟从大数据出发，分析食管鳞癌中COX-2的表达水平，临床组织样本与食管鳞癌细胞系中验证COX-2的表达；收集病历资料，分析COX-2表达与食管鳞癌的临床病理参数及预后的相关性；细胞与动物实验从体内外水平探讨COX-2对食管鳞癌细胞功能的影响；基于转录组测序技术挖掘食管鳞状细胞癌的差异表达基因，利用生物信息学方法，预测食管鳞癌发生与肿瘤进展的可能机制，为食管鳞癌的防治提供新思路；基于COX-2的差异表达，探索新型COX-2荧光探针在食管鳞癌的早期诊断价值，揭示分子标志物的临床转化价值。 方法： （1）通过Oncomine、TCGA、GEO多个数据库分析COX-2在食管癌中的表达情况，通过荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR,qPCR）和蛋白印迹实验（Westernblot,WB）检测临床组织标本食管鳞癌与癌旁、正常食管上皮细胞与食管鳞癌细胞中COX-2转录水平及蛋白水平表达情况。 （2）收集108例食管鳞癌组织及配对的72例癌旁组织制作成组织芯片，采用免疫组织化学法（IHC）检测食管鳞癌及癌旁正常组织中COX-2的表达，同时收集病例随访资料，统计分析COX-2在食管鳞癌患者中的表达与临床病理参数（TNM分期、grade、生存情况、Ki67）的关系。 （3）利用慢病毒载体构建食管鳞癌细胞系（Eca109、KYSE150）稳定敲低和过表达COX-2的细胞模型，RT-qPCR、WB从RNA及蛋白水平验证COX-2的表达。采用CCK-8实验、克隆形成实验、Ki67免疫荧光、流式细胞仪检测细胞周期、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、裸鼠皮下成瘤实验从体内外水平检测COX-2表达对细胞恶性行为（增殖、侵袭能力）的影响。 （4）转录组测序筛选敲低COX-2组及阴性对照组细胞中的差异表达基因，GO分析、KEGG分析及PPI网络分析等生物信息学方法揭示食管鳞癌发生与进展的可能分子机制。 （5）通过新型COX-2荧光探针2a1对食管鳞癌组织与癌旁正常食管组织进行荧光显像；COX-2荧光探针荧光显像已成功构建的敲低和过表达COX-2的KYSE150食管鳞癌细胞；最后通过构建人来源的正常食管上皮、人食管鳞癌上皮及癌旁上皮细胞的类器官，在此基础上，运用新型COX-2荧光探针对这三者进行荧光显像。 结果： （1）查阅Oncomin发现COX-2在包括食管癌在内的多种癌症中表达升高，TCGA数据库进行泛癌分析发现类似结果。提取TCGA及GTEx数据库中的食管癌组织和正常食管组织标本测序结果，进一步的分析发现食管癌组织中COX-2表达水平明显高于癌旁及正常组织，且具有一定的诊断效力。收集三套食管癌GEO数据集进行分析，结果提示食管癌组织中COX-2表达水平较癌旁正常组织显著升高。RT-qPCR和WB检测不同食管鳞癌细胞系EC9706、KYSE150、Eca109、TE-1中COX-2RNA和蛋白表达水平明显高于正常食管上皮细胞Het-1A。收集18对新鲜的食管鳞癌与配对癌旁组织标本，提取RNA和蛋白分别进行RT-qPCR和WB检测，结果显示食管癌组织中COX-2的RNA及蛋白水平显著高于癌旁正常组织。 （2）IHC结果显示食管鳞癌组织中COX-2表达水平高于对应癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.001），且高表达的COX-2与肿瘤大小（P=0.013）、肿瘤病理分化（P=0.031）、肿瘤浸润深度（P=0.036）、淋巴结转移（P=0.029）、TNM分期（P=0.001）、Ki67表达（P=0.001）密切相关，但与患者的年龄、性别无明显相关性。高表达COX-2的食管鳞癌患者生存期较短，可以作为食管鳞癌预后的独立危险因素。 （3）构建稳定敲低和过表达COX-2的细胞模型，并用RT-PCR、WB从RNA及蛋白水平进行鉴定有效；CCK8实验表明敲低COX-2后明显抑制食管鳞癌细胞的体外生长，而过表达COX-2显著促进食管鳞癌细胞的生长；克隆形成实验也表明敲低COX-2后明显抑制食管鳞癌细胞的集落形成能力，而过表达COX-2显著促进食管鳞癌细胞的集落形成能力；Ki67免疫荧光染色显示，敲低COX-2Eca109和KYSE150中的Ki67阳性细胞减少，而过表达COX-2的Eca109和KYSE150中的Ki67阳性细胞增多；流式细胞仪分析细胞周期分布情况，提示COX-2敲低可抑制Eca109和KYSE150的细胞周期进程，过表达COX-2则可促进Eca109和KYSE150的细胞周期进程；Transwell迁移、侵袭实验表明敲低COX-2抑制Eca109和KYSE150食管鳞癌细胞的迁移及侵袭能力，过表达COX-2促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭；裸鼠皮下成瘤实验显示，敲低COX-2组KYSE150食管鳞癌细胞较对照组增殖速度下降，过表达COX-2组食管鳞癌细胞较对照组增殖速度显著增快。 （4）基于RNA-seq技术，COX-2敲低后挖掘到342个食管鳞癌差异表达基因，其中包括237个基因表达上调，下调DEGs有105个；基因富集比较显著的通路包括PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、细胞周期、脂肪酸代谢、DNA修复等通路有关；SERPINE1、ITGA5、EFCAB14、STEAP1、RASSF6、MMP3、SENP3-EIF4A1、SERPINE2、CD177、和IL1R2等基因为COX-2敲低后的下调基因，通过TCGA数据库验证其在食管鳞癌组织中表达水平高于食管癌旁和正常组织，并且它们的表达与COX-2表达具有正相关，由此可见，COX-2可能通过这些下游基因进而参与食管鳞癌的恶性进程。 （5）新型COX-2荧光探针在食管鳞癌的早期诊断价值：COX-2新型荧光分子探针2a1对食管鳞癌及癌旁组织切片进行荧光显像，共聚焦显微镜下观察到食管鳞癌组织切片中有明亮的红色荧光，而癌旁组织中未见明显的红色荧光。2a1对稳转株进行荧光显像，相比各自的阴性病毒对照组中观察到中等强度的荧光，敲低COX-2组只有微弱的荧光，过表达COX-2组则出现较明亮的红色荧光；荧光信号主要分布在食管鳞癌细胞的细胞质中，细胞外和细胞核中未见荧光信号。收集食管鳞癌、癌旁组织及正常食管上皮构建类器官，它能够模拟生理相关的细胞-微环境和模拟癌症微环境的类器官模型，将这些类器官与2a1探针共同孵育，激光共聚焦显微镜下观察，在食管鳞状细胞癌类器官中观察到亮红色的2a1荧光，而其相邻的食管Eos及正常食管Eos分别只检测到微弱的荧光和无荧光。 结论： （1）食管鳞癌组织中COX-2的表达水平高于癌旁正常组织，高表达COX-2的食管鳞癌患者总体生存期较短，COX-2是食管鳞癌不良预后的独立危险因素。 （2）调控COX-2的表达能在体内外实验影响食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。 （3）COX-2的表达与食管鳞癌细胞的增殖、迁移与侵袭等信号通路的调控关系最为密切。 （4）COX-2特异性荧光探针能通过靶向到COX-2蛋白，从而有效区分食管鳞癌组织与癌旁非癌组织、不同来源的食管类器官，表明2a1在临床上具有食管鳞癌早期诊断的潜在应用价值。
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