摘要
右旋糖酐酶能够特异性水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键，在降解蔗汁中右旋糖酐和益生元的制备方面具有良好的应用前景。本研究从海洋中筛选到一株产右旋糖酐酶的菌株，对该菌株生长特性、产酶条件、酶学性质及水解产物进行了研究，主要结果如下： 筛选到了一株产酶菌株G6-4B，并鉴定为氧化节杆菌（Arthrobacteroxydans），该菌株为革兰氏阴性细菌，无芽孢，无鞭毛，菌体呈短杆状，在含有蓝色葡聚糖的平板上，菌落边缘整齐光滑、浅白湿润。该菌株甲基红反应呈阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性，能够利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖等。通过对菌株G6-4B生长条件研究发现：该菌株的最适生长温度为30℃，最适生长pH为7.0，最适生长氯化钠浓度为10g/L。 提取菌株G6-4B基因组送往诺禾致源公司对其全基因组进行测序，根据测序结果分析该菌株基因组信息，找出编码右旋糖酐酶的氨基酸序列，根据氨基酸序列同源性，将氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶归于糖苷水解酶GH49家族，根据氨基酸序列使用在线软件ExPasy与SignalP推测酶蛋白的分子量大小及信号肽等相关信息。得出该菌株所产右旋糖酐酶的分子量为71.12kDa，N端有32个氨基酸的信号肽，GC总含量占比为66.6%。 通过单因素优化试验确定氧化节杆菌G6-4B的最佳产酶条件为：产酶温度为25℃，培养基初始pH为7.5，发酵时间为48h，最佳接种量为4%，诱导剂浓度为10g/L。在上述条件下得到的发酵液，经离心制备成粗酶液后，测得酶活为18.2U/mL。 对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶进行了纯化和酶学性质研究：通过硫酸铵沉淀、超滤和离子交换层析等手段对酶进行纯化，纯化后酶的回收率为10.88%，比酶活为337.69U/mg，纯化倍数为32.25。酶的分子量约70kDa，最适作用温度为55℃，50℃条件下保温5h仍有80%以上的剩余酶活，酶在pH7.0-9.0范围之间稳定。大多数金属离子在不同程度上对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力有抑制作用，并且随着离子浓度的增强，对酶的抑制作用增强，其中Ni2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+离子终浓度在1mM到10mM时能够完全抑制氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力；吐温80对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力有一定的促进作用，而β-巯基乙醇对该酶酶活力有强烈抑制作用，加入β-巯基乙醇后，该酶丧失酶活；通过酶的特异性实验验证了该酶只能特异性水解α-1,6糖苷键；亲和性随着底物右旋糖酐的分子量的增大而增强。 对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶的水解产物及应用进行研究发现：氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶是一种内切型右旋糖酐酶，可随机性水解葡聚糖中的α-1,6-糖苷键。相比较于水解时间和底物的聚合度，氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶的酶浓度对水解产物的种类和比例影响显著。用酶浓度为5U/mL的G6-4B右旋糖酐酶粗酶液于55℃温度下水解0.5%右旋糖酐T20后得到的水解产物用LC-MS分析，产物中IMO3含量高达73.19%，其次为11.58%的异麦芽四糖，异麦芽六糖和异麦芽七糖所占比例分别为8.03%和7.19%。用氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶水解产物做益生元活性实验，验证了其水解产物在一定程度上有增殖有益菌、抑制有害菌的效果。
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