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贝莱斯芽胞杆菌ZF145抑菌物质分析鉴定及发酵工艺优化

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芽胞杆菌是生物防治领域研究最广泛，防治靶标最全面的生防微生物之一，其发酵产生的多种抑菌物质对真菌、细菌等病原体具有较强的拮抗作用。又因其芽胞形态强大的抗逆能力，芽胞杆菌类生物农药货架期长，应用范围广泛，是目前最成功的活体生物农药之一。前期研究以引起黄瓜细菌性角斑病的扁桃假单胞流泪致病变种（Pseudomonas amygdali pv. Labchrymans， Pal）NM002 为指示菌，筛选获得一株高效生防细菌，贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis） ZF145，对黄瓜细菌性角斑病的防治效果达到 71.10%。本研究以贝莱斯芽胞杆菌 ZF145 为研究对象，对其抑菌物质进行提取分析，确定最佳的提取方法；通过HPLC-MS鉴定主要的抑菌物质，明确了主要的抑菌物质；通过 5 L发酵体系优化发酵工艺，利用 20 L、2 m3、5 m3发酵罐进行放大发酵，验证了最佳发酵工艺的可行性，主要内容如下： 1. 建立了贝莱斯芽胞杆菌ZF145适合产业开发的抑菌物质提物方法。本研究使用5种抑菌物质提取方法对贝莱斯芽胞杆菌 ZF145 的发酵液上清进行抑菌物质的提取，通过 HPLC 建立Surfactin的标准曲线，并计算出不同方法制备的贝莱斯芽胞杆菌 ZF145粗提物中 Surfactin的浓度。测定粗提物对Pal的拮抗效果，结合对黄瓜细菌性角斑病的盆栽生测效果结果，确定了提取率最高的方法为酸沉法，制备的粗提物对 Pal 的离体抑菌直径达到 20.67 mm，对黄瓜细菌性角斑病的盆栽生测防治效果可达 47.86%，Surfactin纯度为 63.91%。确定了最适合工业生产的提取方法为絮凝法，其制备的粗提物对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果为 42.85%，Surfactin 的含量达到69.28%。 2. 明确了贝莱斯芽胞杆菌 ZF145合成的C13~C16的Surfactin同系物为主要的抑菌物质。本研究针对絮凝法的提取条件进行了优化，确定了最佳絮凝 pH为 5.0时，从贝莱斯芽胞杆菌 ZF145发酵液上清中制备的粗提物对 Pal 的离体抑菌效果最佳，抑菌圈达到 25.00 mm。通过优化后絮凝法制备的贝莱斯芽胞杆菌ZF145粗提物对3种病原细菌及6种病原真菌具有显著的抑制效果。优化后的絮凝法适合于多种芽胞杆菌抑菌物质的提取。通过葡聚糖凝胶层析获得具有抑菌活性的组分，进行高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）鉴定，明确了贝莱斯芽胞杆菌ZF145抑菌活性组分中主要含有C13~C16的Surfactin同系物。 3. 优化了贝莱斯芽胞杆菌ZF145的5 L发酵体系发酵工艺，确定了最佳发酵工艺。本研究利用5 L发酵罐体系对贝莱斯芽胞杆菌ZF145最佳发酵温度及培养基配方进行筛选。最佳发酵配方为：淀粉25 g·L-1，玉米粉25 g·L-1、豆粕粉40 g·L-1，磷酸氢二钠1 g·L-1、磷酸二氢钠1 g·L-1，中性蛋白酶 1 g·L-1，α-高温淀粉酶 1 g·L-1，消泡剂 1 g·L-1，最佳发酵温度为 32℃。发酵工艺优化后的发酵液活菌数达到 9.40×108 CFU·mL-1，相比于旧工艺提高 3.84倍；通过在贝莱斯芽胞杆菌ZF145发酵过程中补加碳源，可使发酵液中活菌数提升6倍。 4. 验证了贝莱斯芽胞杆菌 ZF145 最佳发酵工艺在不同发酵体系下的发酵效果，确定的发酵工艺可用于贝莱斯芽胞杆菌 ZF145 的工业生产。在 20 L 发酵体系中，获得的发酵液活菌数可达到2.57×109~3.26×109 CFU·mL-1，芽胞率达到76.2%~93.5%；在2 m3发酵体系中，获得的发酵液及粉剂的活菌数分别为 1.42×109 CFU·mL-1、14.9×109 CFU·g-1，对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果分别为 69.08%，61.98%；在 5m3发酵体系中，获得的发酵液及粉剂母药的活菌数分别2.82×109 CFU·mL-1、30.8×109 CFU·g-1，对黄瓜细菌性角斑病的防治效果分别为32.50%、53.22%。 本研究比较并确立了贝莱斯芽胞杆菌 ZF145 抑菌物质的提取方法，明确了贝莱斯芽胞杆菌ZF145中主要的抑菌物质，优化贝莱斯芽胞杆菌ZF145的发酵工艺，通过不同发酵体系的验证，确定了最佳发酵工艺适合于贝莱斯芽胞杆菌ZF145工业化生产。

曾先锋

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杀菌剂 贝莱斯芽胞杆菌 抑菌物质 提取工艺 发酵工艺

硕士

植物病理学

李宝聚

2023

中国农业科学院

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