摘要
禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的一类垂直传染性疫病。根据囊膜蛋白的差异，将ALV分为11个亚群（ALV-A~K），其中，ALV-K是2012年首次在中国分离并鉴定的新型ALV亚群。ALV-K感染鸡后主要导致免疫系统损伤、产生神经胶质瘤、生长迟缓。流行病学调查显示，ALV-K已在我国多个地区的不同品种鸡群中广泛流行，这对我国AL的防控提出了新的挑战。鉴于AL无有效的疫苗或药物，只能依靠种源净化进行防控，但是存在检测周期长、需多个世代反复检测和耗资巨大等缺点。因此，探索更高效、精准的AL防控技术具有重要意义。本研究将鉴定ALV-K细胞受体（Tva）与ALV-K相互作用的关键功能域及可能的关键氨基酸位点，并探讨两者间可能的结合机制。在此基础上利用CRISPR/Cas9技术，构建Tva关键氨基酸位点突变的基因编辑DF-1细胞系，进一步评价其抵抗ALV-K感染的能力，为建立ALV的高效防控技术奠定基础。 序列对比显示，人低密度脂蛋白受体重复4（huLDLR4）与Tva有很高的相似性，但其不能介导ALV-K进入宿主细胞。为鉴定Tva介导ALV-K进入宿主细胞的受体关键功能域，本研究首先将Tva中的两个loop区（N-terminal loop及C-terminal loop）分别与huLDLR4相应区域互补替换。受体结合、免疫共沉淀（Co-IP）及病毒感染实验结果证明C-terminal loop替换后Tva不能与ALV-K gp85蛋白相互作用，也不能介导ALV-K进入宿主细胞。进一步以半胱氨酸为节点将C-terminal loop分为3段（S1、S2及S3），分别与huLDLR4相应片段替换，Co-IP和病毒感染实验表明：S1、S2或S3替换后均会降低Tva与ALV-K gp85蛋白的结合能力以及其介导ALV-K进入宿主细胞的能力。为鉴定Tva介导ALV-K进入宿主细胞的关键氨基酸位点，将Tva C-terminal loop中与huLDLR4不同的9个氨基酸分别进行点突变，病毒感染实验结果显示E37、L39、H43和G54突变成huLDLR4相应的氨基酸后，导致Tva介导ALV-K进入宿主细胞的能力明显减弱。随后，以huLDLR4为骨架，与Tva上相应氨基酸或区段进行替换，结果显示只有将huLDLR4C-terminal loop中与Tva不同的氨基酸均替换为Tva中相应氨基酸后，huLDLR4才能完全获得与ALV-K gp85蛋白相互作用并介导ALV-K进入宿主细胞的能力。这些结果表明C-terminal loop是Tva行使受体功能的最小功能域，其中E37、L39、H43和G54是影响Tva介导ALV-K进入宿主细胞的关键氨基酸位点。 为进一步探索Tva关键氨基酸位点在ALV-K抗病毒技术中的应用，以上述鉴定的4个关键氨基酸位点位靶点，利用CRISPR/Cas9技术构建了Tva基因编辑的DF-1突变细胞系（Tva-M DF-1）。CCK-8细胞活性检测结果显示，Tva基因突变对DF-1细胞的活性没有明显影响。ALV-K病毒感染与复制检测结果表明，TvaM DF-1能够有效抵抗ALV-K的进入，并对ALV-K的复制具有完全抑制作用。 本研究首次鉴定了Tva蛋白中介导ALV-K进入宿主细胞的关键功能域及关键氨基酸位点，并在此基础上利用CRISPR/Cas9技术构建了一株能抵抗ALV-K感染的基因编辑DF-1突变细胞系。这些结果不仅为研究ALV-K的入侵机制奠定了基础，更为ALV-K的抗病研究提供了靶点。
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